猪流行性腹泻病毒乳汁中sIgA ELISA检测方法的初步建立

摘要

猪流行性腹泻（Porcine epidemic diarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）引发的主要危害初生仔猪的一种急性传染病，临床以呕吐、腹泻、身体消瘦及脱水为主要临床特征。该病不论任何年龄、任何品系均可感染，出生后7日龄以内的仔猪最为易感，且死亡率高达100%。近几年，PED在全球的流行范围之大，危害之严重，给养猪业带来了巨大的损失。因此，对于该病的防治和诊断具有重要的现实意义。　　S蛋白作为PEDV病毒表面的结构蛋白，由S基因所编码，S1具有多个B细胞中和抗原表位，是动物机体产生中和抗体的主要抗原蛋白。本研究以本实验室PEDV分离株 CHYJ130331 基因序列设计一对特异性引物，从 S 基因上扩增出一段具有中和抗原表位的截短S1片段。将PCR扩增得到的1062 bp的基因片段纯化回收后，克隆到载体PMD-18-T上，通过测序分析，结果与毒株序列号CHYJ130331进行比对，核苷酸序列同源性为 100%；然后再将克隆化截短 S1 基因亚克隆到原核表达载体pGEX-4T-1 中，获得了原核表达质粒 pGEX-4T-S；再将重组质粒转化到表达宿主菌E.coli BL21（DE3）中，加入诱导剂IPTG，表达目的蛋白。同时优化诱导表达条件，当加入终浓度为0.6 mmol/L的IPTG，37℃条件下，诱导时间4 h时，蛋白表达效果最佳。经SDS-PAGE鉴定，结果显示，S1截短蛋白的分子量为72 KD，与预期大小一致。利用 GST 标签试剂盒对目的蛋白进行纯化，获得纯度较高的重组蛋白。Western-blotting鉴定结果显示，纯化的S1截短蛋白可以与PEDV阳性血清发生特异性结合，说明该纯化蛋白反应原性较好。　　母乳中含有大量的sIgA，因此，本研究利用AKATA 制备型液相色谱蛋白分析仪从乳汁中分离纯化得到sIgA。纯化的sIgA经鉴定后，免疫两只SPF新西兰大耳兔制备兔抗猪sIgA阳性血清，对该阳性血清进行HRP标记，获得兔抗猪sIgA的酶标二抗。　　利用纯化的 S1截短蛋白作为抗原进行包被，通过对各反应条件的优化，最终确定了乳汁中 sIgA 的间接 ELISA 检测方法的最佳反应条件：抗原包被浓度为 12.5 μg/mL，经37℃作用1 h后，4℃包被过夜；用封闭液（含1%BSA的PBST）37℃封闭90 min；待检乳汁用含有100mg/mL胃蛋白酶的醋酸钠溶液做40倍稀释后于37℃反应1 h；酶标二抗（用封闭液做1∶1000倍稀释）于37℃反应45 min；加入底物后避光显色10 min。阴、阳性乳汁的临界值为0.371。对该方法进行特异性和重复性试验，结果显示，建立的方法可用于检测乳汁中的PEDV抗体检测，且具有良好的特异性和重复性。运用此方法对采自广东地区的120份乳汁进行临床样品抗体检测，检出样品的阳性率为38.33%（46/120），与韩国安捷公司IgA抗体检测试剂盒进行对比，两者的符合率为80.0%。

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