H5N6亚型禽流感病毒遗传属性、致病性及宿主抗病毒因子的研究

摘要

禽流感是我国养禽业的主要传染病之一，其每年给我国家禽养殖业造成巨大的损失，且时而出现感染人的事件。另外，家禽作为禽流感病毒的宿主和易感动物，其如何与病毒相互作用及哪些宿主抗病毒蛋白参与它们的互作仍然完全不清楚。基于上述原因，本文将研究2015-2016年我国华南地区H5N6禽流感病毒的遗传属性、致病性和其感染鸡后TRIM类蛋白等相关抗病毒因子的表达情况。　　本研究8株H5N6禽流感病毒的HA蛋白的裂解位点均为-RRRKR↓G-类型，且在裂解位点附近存在5个连续的碱性氨基酸，这符合高致病性禽流感病毒的分子特征。8株病毒NA蛋白在58-68位出现11个氨基酸的缺失。它们的PB2蛋白在627位的氨基酸均为E，这符合禽源禽流感病毒的分子特征。它们的M1蛋白在30位的氨基酸均为D，在215位的氨基酸均为A。本研究8株H5N6禽流感病毒的遗传进化分析，发现它们的HA基因均来源于Clade 2.3.4.4分支，且HA、M、NS、NP、PB2、PA基因及WB220和GS475毒株的PB1基因均属于MIX-like分支，而GS140、GS142、CK146、CK152、CK274、GS474毒株的PB1基因则位于VN2014-like分支，这表明本研究中8株毒属于不同的基因型，且部分毒株出现不同基因型的重组。　　为了了解H5N6禽流感病毒对鸡的致病性及病毒在鸡群中的传播能力，选取CK146、GS474禽流感病毒，以 0.1 mL 105EID50/0.1mL的剂量点眼滴鼻感染4周龄的SPF鸡。结果显示，接种CK146和GS474禽流感病毒的SPF鸡平均死亡时间分别为3天和3.38天。两株病毒均可以在所有接种组鸡被检测的组织中复制。CK146和GS474同居组鸡的平均死亡时间分别为4.25天和6.2天。两株病毒均可以在所有同居组鸡被检测的组织中复制。无论是接种组还是同居组的鸡，均可以在口咽和泄殖腔拭子中检测到病毒。因此，本研究中的H5N6禽流感病毒对鸡具有较高的致病性，在鸡的组织器官中具有较强的复制能力，且这两株病毒均可以通过鸡的消化道和呼吸道被排出，但其在鸡群中的接触传播能力不同。　　为了了解H5N6禽流感病毒感染鸡后宿主抗病毒相关因子的变化，禽流感病毒感染鸡和鸡成纤维细胞，发现宿主抗病毒蛋白（TLR3、MDA5、MAVS、MX1、OAS、TRIM13、TRIM25）和细胞因子（IL-6、IFN-β）的表达量有所升高。克隆和鉴定了鸡TRIM13、TRIM25 基因，初步分析它们的功能。在鸡成纤维细胞细胞中过表达chTRIM25，发现TLR-3、MDA5、MX1、OAS及IFN-β的表达量明显上调，这说明TRIM25可以促进I型干扰素介导的抗病毒天然免疫反应。　　本研究中的8株H5N6禽流感病毒均为高致病性禽流感病毒，且部分毒株出现不同基因型的重组。CK146、GS474禽流感病毒对鸡表现为高致病性，且其在鸡群中具有较强的水平传播能力，并且通过接种和接触可以完全致死SPF鸡。H5N6禽流感病毒感染鸡和鸡成纤维细胞后MDA5、MAVS、TRIM13、TRIM25、IFN等宿主抗病毒相关因子的表达量均上调，因此该亚型病毒感染宿主后会刺激宿主抗病毒相关因子的表达而发挥抗病毒作用。本研究成功克隆了鸡TRIM13、TRIM25基因，初步分析它们的功能，并发现TRIM25可以促进I型干扰素介导的抗病毒天然免疫反应。因此，本研究为了解H5N6禽流感病毒的遗传属性和其感染宿主后激发的宿主抗病毒天然免疫反应提供实验数据。

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Genetic Characteristics, Pathogenicity and Host An

1 前言

1.1 禽流感病毒的研究进展

1.1.1 A型禽流感病毒的分子结构

1.2 H5亚型高致病性禽流感病毒危害

1.3 宿主抗病毒相关因子

1.3.1 Toll样受体TLRs

1.3.2 RLRs受体

1.3.3 线粒体抗病毒信号蛋白MAVS

1.3.4 TRIM蛋白

1.3.5 MX蛋白

1.3.6 OAS蛋白

1.3.7 白细胞介素

1.4 本研究的目的及意义

2.1 材料

2.1.1 病毒

2.1.3 分子生物学相关试剂

2.1.4 相关试剂的配制

2.1.5 主要仪器

2.1.6 生物信息学软件

2.2 方法

2.2.3 病毒的分离与纯化

2.2.4 病毒片段的扩增

2.2.5 各基因片段的序列测定和分析

2.2.6 H5N6禽流感病毒致病性研究

2.2.7 H5N6禽流感病毒感染宿主后主要抗病毒相关因子的研究

2.2.8 鸡TRIM13、TRIM25基因克隆、鉴定及其功能初步分析

2.2.9 荧光定量PCR数据处理分析

3.1 H5N6禽流感病毒遗传属性的分析

表3.1 H5N6亚型毒株各基因来源及重组分析

3.2 H5N6禽流感病毒的致病性分析

3.2.1 EID50测定结果

3.2.2 病毒对鸡的致病性

3.2.3 病毒在鸡群中的传播能力

3.3 H5N6禽流感病毒感染宿主后主要抗病毒相关因子的分析

3.3.1 CK146接种组第3天肺脏内抗病毒相关因子表达情况

3.3.2 病毒感染CEF后诱导的免疫反应

3.4 鸡TRIM13、TRIM25基因克隆、鉴定及其功能初步分析结果

3.4.1 鸡TRIM13基因（chTRIM13）克隆与鉴定

3.4.2 鸡TRIM25（chTRIM25）基因与鉴定

3.4.3 chTRIM25基因表达

3.4.4 过表达chTRIM25的CEF后诱导的免疫反应

4.1 遗传属性的分析

4.2 H5N6禽流感病毒致病性的研究

4.3 抗病毒相关因子的研究

4.4 全文总结

致 谢

参考文献

附录