ZIP12基因在腹水综合征肉鸡组织中表达和分布的研究

摘要

肉鸡腹水综合征（ascites syndrome，AS）是一种发生于快速生长肉鸡的营养代谢病，以右心衰竭和腹腔腹水蓄积为特征。从病理组织学的角度看，肺血管重构（pulmonary vascular remodeling，PVR）及其引起的肺动脉高压（pulmonaryhypertension， PH）是肉鸡腹水综合征发生的基础。研究表明，锌转运载体ZIP12在缺氧小鼠的肺血管重构上起到了关键的调节作用，抑制ZIP12表达可以减弱PVR与PH的发展，这提示ZIP12可能是肺动脉高压的重要调节基因。肉鸡腹水综合征发生的关键环节也是肺动脉高压，ZIP12 在肉鸡的腹水综合征病理发生中是否也具有类似的作用需要进一步研究。本研究通过静脉注射 CM-32 离子交换纤维素悬液的方法成功制备了腹水综合征动物模型，利用RT-PCR和免疫组织化学方法检测了亚临床和腹水肉鸡各个组织中的ZIP12相对表达量和蛋白的分布，并比较了它们之间的差异。研究结果证明ZIP12基因在肉鸡腹水综合征的发生中具有重要意义，为发展该病新的防控方法提供科学的基础数据。具体研究内容如下：　　1．肉鸡腹水综合征模型的构建　　将120只1日龄肉鸡分为空白组（n=30）和实验组（n=90），所有鸡均自由采食并提供 24 小时的光照。20 日龄时，实验组通过静脉注射 CM-32 离子交换纤维素悬液，空白组注射等量生理盐水。42日龄时采取所有鸡的心脏和血液，剖检时观察肉鸡有无病变，测定右心室重量与全心室重量之比（mrv/mtv）、血清中的谷草转氨酶（AST）与肌酸激酶（CK）的活性。结果发现实验组肉鸡出现了严重的腹水和右心室肥大。与对照组相比实验组肉鸡的mrv/mtv值、AST活性、CK活性均显著升高且mrv/mtv值大于 0.3。结果证明，我们构建的模型稳定且与国内外采用注射纤维素颗粒的方法造模得到的结果相一致。　　2．ZIP12基因的克隆及序列分析　　运用 RT-PCR 方法扩增了肉鸡 ZIP12 基因并提交至 GenBank ，获得登录号KU178951。序列分析显示ZIP12基因表现出种属内保守性和种属间差异性，编码613个氨基酸，蛋白大小为69 KD，存在多个潜在跨膜区，含有信号肽。　　3．肉鸡ZIP12蛋白原核表达及多克隆抗体制备　　针对ZIP12基因设计带有双酶切位点的特异性引物，将扩增出的基因片段连接至pGEX-6P-1原核表达质粒。将构建成功的表达质粒转化至表达细菌BL21（DE3），经IPTG 诱导，成功表达出了重组蛋白。将纯化后的蛋白与佐剂制备成疫苗免疫新西兰大白兔并成功制备出兔抗 ZIP12 多克隆抗体，抗体经 Western-Bolt 和 ELISA 检测证实，制备的多抗效价高、特异性强。　　4．ZIP12在肉鸡腹水综合征组织中表达与分布研究　　运用RealTime PCR方法分别检测了空白组、亚临床组、腹水组肉鸡心、肝、脾、肺、肾中的ZIP12 mRNA表达水平。结果显示ZIP12在亚临床组和腹水组肉鸡的肝、肺中表达量显著高于空白组（P<0.01）。利用制备抗体进行上述组织的免疫组织化学检测，结果显示 ZIP12 广泛分布于各组织中，结合平均光密度（IOD）分析发现 ZIP12蛋白的表达量相比于空白组有了明显的上升。结果表明：肉鸡腹水综合征发生时， ZIP12作为效应蛋白在该病的病理发生中具有重要作用。

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