宿主源糖类化合物诱导Xcc致病性及DSF信号合成机理研究

摘要

野油菜黄单胞菌致病变种（Xanthomonas campestris pv.campestris，Xcc）是引起十字花科植物黑腐病的致病菌。Xcc 能通过气孔、胚芽、伤口等侵入宿主植物维管束引起组织坏死和叶枯萎。黑腐病在全国各地均有蔓延，蔬菜的品质和产量都受到很大影响。因此本课题以黄单胞菌为代表，从基因层面剖析微生物的致病调控机理以及与寄主的互作关系，为生产上防治黄单胞菌奠定理论基础。　　Xcc产生的DSF家族(Diffusible signal factor family)信号分子可以介导群体感应（Quorum sensing，QS）系统以调节细菌趋化性、运动性、生物膜、致病性等生物学功能。高等植物中碳水化合物主要是以糖，尤其是蔗糖的形式从源运输到非光合作用的库组织。其中糖转运蛋白（sugars will eventually be exported transporters，SWEET）可对多种单糖以及蔗糖进行运输，在植株生殖发育、宿主-病原菌互作过程中都起到重要的调控作用。当病原菌侵染植物时会诱导植物中SWEET基因mRNA的表达，故病原菌有可能胁迫植物中的SWEET系统从而获取营养。　　前期研究表明，Xcc 可以利用经乙醇萃取后的寄主植物中的代谢物尤其是葡萄糖来促进 DSF 信号的合成，然而，目前还不清楚 Xcc 如何从宿主植物的代谢产物中获益。本课题对Xcc的QS系统和宿主植物的SWEET系统之间可能存在的潜在关系进行了初步的研究。主要研究结果如下：　　1、通过RNA-Seq数据分析并比较了在有无白菜汁培养条件下Xc1菌株的基因谱表达情况，其差异基因表达分析显示有大量的基因表达水平受到影响。其中相当一部分基因是受DSF系统调控。因此白菜汁对Xcc中DSF信号介导的QS系统起着重要作用。　　2、DSF高产菌株Xc1ΔrpfC在添加白菜汁培养的条件下通过监测发现12h内DSF和BDSF的产量均显著增加。由于白菜汁含有比较丰富的蔗糖和葡萄糖，ΔrpfC添加葡萄糖培养4小时后，DSF和BDSF的产量与普通培养基NYG培养的相比显著增加。而添加蔗糖在Xcc早期阶段几乎不影响DSF家族信号合成，但在接种24小时后DSF和BDSF的产量均显著上升。　　3、通过大量筛选T-DNA插入突变的AtSWEET1 - AtSWEET13的T3代杂合拟南芥，成功得到T4代AtSWEET4和AtSWEET8纯合突变体。CFU数据表明外源糖促进了细菌的毒力和繁殖。荧光定量RT-PCR分析显示受Xc1感染的拟南芥SWEET基因的mRNA有不同程度的表达。并且AtSWEET4和AtSWEET8的突变均降低了病原体的毒力和繁殖，添加外源糖感染后发现病原体数目上升。因此推测 AtSWEET突变体中Xcc的致病性降低可能由糖的输出限制引起。　　4、定量RT-PCR分析显示Xc1感染引起拟南芥中蔗糖转化酶基因表达水平的上调，外源添加白菜汁培养也诱导了Xc1的蔗糖水解酶基因的表达。体外酶活结果表明蔗糖被 CINV1 或 XC_0805 蛋白催化裂解产生葡萄糖和果糖。过表达 CINV1 或XC_0805的ΔrpfC在无蔗糖培养的情况下DSF产量与ΔrpfC相比没有明显差异，但在蔗糖存在的条件下，过表达CINV1或XC_0805的菌体DSF信号产量均增加了。表明蔗糖水解酶的存在促使蔗糖裂解产生葡萄糖以此促进DSF生物合成。　　因此，本课题的研究工作提供了确切的理论依据来支持这一理论，即Xcc靶向调控糖转运系统和蔗糖水解酶从而利用寄主植物的糖作为营养物和底物来增强致病性及促进DSF信号生物合成。

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