水稻纹枯病菌新真菌病毒的筛选及基因组结构分析

摘要

水稻纹枯病是水稻种植过程中的三种主要病害之一，给水稻的产量和质量带来了严重的危害。到目前为止，尚无高抗纹枯病的水稻品种可利用，因此水稻纹枯病的防治主要依靠化学方法。由于化学防治对环境的危害性，因此开辟新的绿色环保的水稻纹枯病防治途径显得尤为重要。　　真菌病毒是一类侵染真菌并寄生于其体内的病毒，因为部分真菌病毒能对其寄主的致病力造成显著的减弱效果，因此这类真菌病毒在生防应用上具有广泛的应用价值，同时也为水稻纹枯病的防治提供了新的思路，但水稻纹枯病菌中的真菌病毒研究起步较晚，进展缓慢。　　本研究以本实验室保存的水稻纹枯病菌（Rhizoctonia solaniAG-1 IA）菌株为研究材料，在水稻纹枯病菌中已报道的真菌病毒的基础上，通过分子检测技术检测其体内所含有的双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA），以期发现更多的新的真菌病毒；对其中一个菌株 D168 中携带的真菌病毒进行了提取和序列获取，并对其基因组结构和系统发育地位进行了研究。主要研究结果如下：　　（1）在水稻纹枯病菌中已报道的RsRV1, RsPV2和RsRV-HN008病毒的基础上，从本实验室前期筛选得到的 16 个携带真菌病毒的水稻纹枯病菌菌株中鉴定得到 8个只携带新真菌病毒的菌株，并选择其中的 D168 菌株中所含的真菌病毒作进一步的深入研究。　　（2）在水稻纹枯病菌中已发现的RsRV1, RsPV2、RsRV3、RsRV-HN008和RsRV4真菌病毒的基础上，通过对本实验室保存的水稻纹枯病菌菌株进行真菌病毒的进一步筛选，并结合本实验室前期筛选得到的携带真菌病毒的水稻纹枯病菌菌株，一共鉴定得到4个只携带新真菌病毒的菌株。　　（3）从水稻纹枯病菌 D168 菌株中分离得到一种新的真菌病毒，该病毒由dsRNA-1和dsRNA-2两个片段组成；经序列同源性分析发现，该病毒的序列与水稻纹枯病菌中已报道的双分体病毒RsPV2的序列相似度最高，为61%。因此，初步判定其为一种新的双分体病毒，并将其命名为Rhizoctonia solani dsRNA virus 4 (RsRV4)，该序列已提交到NCBI数据库。　　（4）对RsRV4基因组结构的分析表明，dsRNA-1 和 dsRNA-2的长度分别为1990 bp和1731 bp，均含有一个ORF，分别编码病毒依赖RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRp）和外壳蛋白（coating protein, CP）；同时，该病毒的末端比对发现，dsRNA-1片段的5’末端与dsRNA-2片段的5’末端、dsRNA-1片段的3’末端与dsRNA-2片段的3’末端均具有较高的保守性。　　（5）以病毒RsRV4以及其他23个真菌病毒的RdRps为基础进行的系统发育分析表明，RsRV4与Rhizoctonia solani dsRNA virus 2、Spinach crypticvirus 1、Beet cryptic virus 1以及White clover cryptic virus 1共同聚在甲型（?）双分体病毒属（Alphapartitivirus）谱系中，并且与我们实验室先前在水稻纹枯病菌中发现的双分体病毒RsPV2聚在同一个分支中，表明这两个病毒的亲缘关系较近，与同源性分析的结果一致，再次证明了该病毒为一种新的甲型（?）双分体病毒。　　（6）菌株D168与GD118的菌核均较多，菌株D168的生长速率与菌株GD118较相似，但致病力要弱于菌株GD118，推测RsRV4的存在可能会对菌株D168的致病力造成一定的影响。

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