MaEBF1互作蛋白筛选及关键基因在低温胁迫引起粉蕉后熟障碍中的表达分析

摘要

粉蕉（Musa ABB group，Pisang Awak）属于芭蕉属香蕉杂交栽培种，品质风味好，经济价值高，但采收时成熟度较高，保鲜难度大。采用低温贮运可延长保鲜期，而贮运温度过低、时间过长，以及冬季成熟的粉蕉果实，都会发生冷害，导致果实后熟障碍，表现出果心不能正常软化、果皮转黄不良，淀粉降解被抑制。本文试验以11℃贮藏粉蕉为对照，系统地研究了低温胁迫（7℃）对粉蕉贮藏和后熟期间生理及淀粉降解酶基因表达的影响；构建粉蕉低温胁迫后熟障碍cDNA文库，以乙烯信号转导关键元件MaEBF1为诱饵，筛选与之互作的蛋白并进行功能分析；挑选与成熟及抗冷性相关的互作蛋白基因进行RT-qPCR表达验证，以期深入解析低温胁迫引起粉蕉果实后熟障碍的机制，为粉蕉保鲜提供理论指导。　　主要结果如下：　　1. 粉蕉果实在7℃和11℃下贮藏12 d时仍处于青硬状态，果实在7℃贮藏6 d后出现冷害，12 d冷害较严重，冷害指数约为2.2。分别在贮藏到第3 d、6 d、12 d时将粉蕉移至室温下催熟，研究低温胁迫对果实后熟的影响。与贮藏于适温11℃（低温对照）的粉蕉相比，在7℃贮藏3d后催熟的粉蕉，其表型差异不大，后熟进程基本一致；而7℃低温贮藏6 d和12 d的粉蕉果实后熟的软化和转黄进程受到明显抑制，在7℃贮藏6 d后催熟的粉蕉达到完熟的时间比11℃对照果实延迟2 d，果心软化不完全；7℃贮藏12 d的果实后熟明显受抑制果实不能正常软化，且果皮转黄颜色不均匀。　　2. 检测了低温胁迫下9个粉蕉淀粉降解相关酶基因（PWD1、GWD1、AMY2B/3、BAM4/7、SEX4、LSF1、ISA3）的表达情况。采后直接在室温（25℃）贮藏的粉蕉果实后熟过程中这9个基因的表达趋势均呈上调，而在低温贮藏的果实中均受到明显抑制；7℃低温胁迫抑制了催熟期间PWD1、GWD1、AMY3、BAM4/7、SEX4、ISA3等基因的表达，且低温胁迫时间越长抑制作用越明显，而AMY2B、LSF1等基因并未受到明显的抑制作用。　　3. 采用 Invitrogen 体系，通过 Gateway 位点特异性重组技术构建低温胁迫下粉蕉果实cDNA文库。利用酵母双杂交技术从文库中筛选MaEBF1的互作蛋白并通过回复杂交确定了33个蛋白与诱饵蛋白为阳性互作。这些蛋白中4个含锌指结构域，在植物抗逆性方面具有重要作用；2个为液泡分选蛋白相关基因，对于胞内囊泡运输、维持细胞极性有重要作用；3个与激素（乙烯、生长素、脱落酸）信号转导有关；6个与植物的抗性相关，其中CHIT-like、CHIT、NAC67-like、HSA32这4个基因与植物抗寒性有关；2个与物质运输有关；3个与蛋白降解有关；还有5个未知功能的基因。　　4. 选取筛选结果中出现频率较高和与抗冷性相关的蛋白基因（VPS18/36、P21-like、BEL1-like、ZFN33-like1、ZFN33-like2、CHIT-like、CHIT、NAC67-like、HSA32和一个没有功能注释的基因unknown 1）进行荧光定量验证，在低温贮藏过程中，低温抑制VPS18、P21-like、BEL1-like基因的表达，而增强ZFN33-like1、ZFN33-like2、unknown 1基因的表达，但是对CHIT-like、CHIT、HSA32、VPS36基因表达的影响不大；催熟后粉蕉果实中，VPS18、P21-like、BEL1-like、NAC67-like基因在冷害果实中的表达量受到明显抑制，CHIT-like、CHIT、HSA32和VPS36的表达与冷害没有明显关系，ZFN33-like1、ZFN33-like 2、unknown 1基因在室温下表达量较低。

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1 前言

1.1 研究的目的和意义

1.2 国内外研究现状和发展趋势

1.2.2 粉蕉果实冷害机制研究进展

1.2.3 果实淀粉降解相关研究进展

1.3 研究内容

2.1 供试材料

2.2 试验处理与取样方法

2.2.1 低温胁迫对粉蕉果实后熟的影响

2.2.2 取样方法

2.3 表型及生理指标测定方法

2.3.1 粉蕉转黄指数

2.3.2 粉蕉冷害指数

2.3.3 粉蕉果实硬度

2.4 低温胁迫粉蕉果肉样品酵母cDNA文库的构建

2.4.1 粉蕉果肉RNA的提取

2.4.2 mRNA的分离

2.4.3 cDNA初级文库的构建

2.4.4 PGADE-T7酵母双杂交文库的构建

2.4.5 cDNA文库质量检测

2.5 酵母双杂交筛选PGBKT7-EBF1互作蛋白

2.5.1 PGBKT7-EBF1毒性检测

2.5.2 EBF1互作蛋白的筛选

2.5.3 酵母质粒抽提

2.5.4 回复杂交

2.6粉蕉果实基因荧光定量PCR检测

2.6.2 粉蕉果肉RNA检测

2.6.3 粉蕉果肉cDNA模板的制备

2.6.4 荧光定量引物设计与合成

2.6.5 引物验证

2.6.7 目的基因荧光定量

2.7 数据统计与作图

2.8 主要仪器设备

3 结果与分析

3.1 低温胁迫对粉蕉果实贮藏和后熟期间生理变化的影响

3.1.1 粉蕉果实硬度的变化

3.1.2 粉蕉果实转黄指数的变化

3.1.3 粉蕉果实冷害指数的变化

3.2.1 粉蕉果肉葡聚糖磷酸激酶基因PWD1和GWD1的表达

3.2.2 粉蕉果肉α-淀粉酶基因AMY2B/3的表达

3.2.3 粉蕉果肉β-淀粉酶基因BAM4/7的表达

3.2.4 粉蕉果肉磷酸葡聚糖去磷酸酶基因SEX4，LSF1的表达

3.2.5 粉蕉果肉淀粉去分支酶基因ISA3的表达

3.3 粉蕉果肉淀粉降解相关酶基因表达与生理指标的相关性分析

3.3.1 不同温度贮藏期间粉蕉果肉淀粉降解相关酶基因表达与生理指标相关性分析

3.3.2 低温贮藏催熟期间粉蕉果实淀粉降解相关酶基因表达与生理指标相关性分析

3.4 低温胁迫粉蕉果肉酵母cDNA文库的构建

3.4.1 粉蕉果肉RNA提取

3.4.2 cDNA合成

3.4.3 文库质量检测

3.5 MaEBF1互作蛋白筛选

3.5.1 PGBKT7-EBF1毒性检测

3.5.2 杂交效率

3.5.3 筛选到的总克隆数及阳性克隆数

3.5.4 互作蛋白片段插入情况检测

3.5.5 插入片段质粒测序结果

3.5.6 回复杂交

3.5.7 粉蕉果实诱饵基因EBF1和猎物基因表达分析

3.6 粉蕉果实猎物基因表达与生理指标的相关性分析

3.6.1 不同温度贮藏期间粉蕉果实猎物基因表达与生理指标相关性分析

3.6.2 低温贮藏催熟期间粉蕉果实猎物基因表达与生理指标相关性分析

4 讨论

4.1 低温胁迫导致粉蕉果实后熟障碍的生理特点

4.2 低温胁迫对粉蕉果实淀粉降解相关基因表达的调控及其与后熟障碍发生的关系

4.3 粉蕉果肉后熟障碍酵母cDNA文库的构建及MaEBF1互作蛋白的筛选

4.4 低温胁迫对粉蕉果实猎物基因表达的调控及其与后熟障碍发生的关系

全 文 结 论

致 谢

参 考 文 献

附录A 低温贮藏粉蕉表型图片

附录B 低温贮藏后催熟期间粉蕉表型图片

附录C 荧光定量引物设计列表