脯氨酰甘氨酸对肝脏IGF-1表达与分泌的影响及机制

摘要

胰岛素样生长因子1(IGF-1)是促进动物生长发育的一种重要的内分泌因子,主要由肝脏合成并分泌,并受垂体分泌的生长激素(GH)的调控.新的研究表明,血液中的营养物质(如蛋白质及其产物氨基酸及小肽等)对肝脏分泌IGF也具有重要影响.脯氨酰甘氨酸(Pro-Gly，PG)是一种人血清中自然存在的二肽,具有促进成纤维细胞的蛋白合成等生物学作用,迄今对Pro-Gly能否影响肝脏分泌IGF-1尚未见报道.　　为研究 Pro-Gly 二肽对肝脏 IGF-1 表达与分泌的影响,试验首先选用 C57BL/6J雌性小鼠为对象,设计了以下两个实验:(1)一次性腹腔注射Pro-Gly对小鼠肝脏IGF-1表达与分泌的短期效应:将18只6周龄雌性小鼠随机分为3组(对照组、Pro-Gly二肽组、Pro+Gly组),分别腹腔注射等量的生理盐水、100 mg/kg的Pro-Gly二肽、58 mg/kg的Pro+43 mg/kg的Gly(即两种氨基酸的复合组).注射后1 h采集小鼠肝脏组织和血清,采用实时荧光定量PCR法(RT-qPCR)检测IGF-1相关基因mRNA的表达,蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测IGF-1的蛋白表达以及放射免疫法(RIA)检测小鼠血清中IGF-1的含量.结果发现,小鼠急性腹腔注射Pro-Gly1 h后,肝脏IGF-1的mRNA及蛋白表达水平和血清中IGF-1的含量均显著升高,胰岛素样生长因子结合蛋白1(IGF-BP1)和胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGF-BP3)的mRNA表达显著降低(P＜0.05);(2)多次腹腔注射Pro-Gly对小鼠肝脏IGF-1表达与分泌的长期效应:将30只4周龄雌性小鼠随机分为3组(对照组、Pro-Gly二肽组、Pro+Gly组),分别腹腔注射等量的生理盐水,150 mg/kg的Pro-Gly,87mg/kg的Pro+57mg/kg的Gly.隔天注射一次,35 d后采样.结果发现,与Pro+Gly组相比,长期腹腔注射Pro-Gly二肽可显著提高小鼠体重及体增重(P＜0.05);与生理盐水组相比,注射Pro-Gly显著降低了小鼠脂肪含量(P＜0.05),对肌肉含量则无显著影响(P＞0.05); 注射Pro-Gly还显著升高了小鼠褐色脂肪组织指数,显著降低了卵巢周脂指数(P＜0.05),胫骨指数有升高的趋势(P=0.06);Pro-Gly显著促进小鼠肝脏IGF-1的基因拷贝数、蛋白表达和血清IGF-1的含量(P＜0.05).　　为了在细胞水平验证 Pro-Gly 对肝脏 IGF-1 分泌的作用,试验以人肝癌细胞系HepG2细胞为对象,在培养液中分别添加不同浓度(0、0.2、0.5和1 mM)的Pro-Gly二肽处理HepG2细胞24 h(n=6),采用RT-qPCR检测IGF-1相关基因mRNA的表达，Western blot检测IGF-1的蛋白表达以及RIA检测细胞上清中IGF-1的含量.结果表明:0.5 mMPro-Gly二肽的作用最为显著和稳定,可以显著促进IGF-1 mRNA、蛋白的表达和细胞上清中IGF-1的含量(P＜0.05),降低IGF-BP3 mRNA的表达(P＜0.05).而两种氨基酸复合组Pro+Gly并无促进IGF-1表达与分泌的效应(P＞0.05).以上结果表明:Pro-Gly二肽可以促进C57BL/6J雌性小鼠的生长性能,提高小鼠肝脏和HepG2细胞IGF-1的表达及分泌,而单体氨基酸(Pro或Gly)的复合处理均无此作用.　　为了研究Pro-Gly促进肝脏IGF-1表达与分泌的机制,进一步采用蛋白质免疫共沉淀(co-IP)、免疫细胞化学(ICC)和Western blot检测了IGF-1分泌的相关信号通路的影响.研究发现,0.5 mM的Pro-Gly处理HepG2细胞6 h后,JAK2与STAT5蛋白之间的结合明显增强,p-STAT5转位进入细胞核的效应明显增强;小鼠短期腹腔注射100 mg/kg的Pro-Gly和长期腹腔注射150 mg/kg的Pro-Gly均能显著升高肝脏JAK2/STAT5 信号通路的磷酸化水平(P＜0.05).进一步利用 JAK2 阻断剂 AZD1480在细胞和活体水平上分别进行JAK2阻断试验.(1)离体试验:1μM的AZD1480和0.5mM的Pro-Gly处理HepG2细胞6 h或24 h后,JAK2、STAT5的磷酸化水平显著抑制(P＜0.05),p-STAT5转位进入细胞核的效应也被抑制,Pro-Gly促进IGF-1表达与分泌的作用被逆转(P＞0.05).(2)在体试验:小鼠腹腔共注射Pro-Gly(100 mg/kg，1 h)和AZD1480(30mg/kg,3 h)后,小鼠肝脏中JAK2、STAT5蛋白的磷酸化水平显著降低(P＜0.05),Pro-Gly不再促进IGF-1的表达与分泌(P＞0.05).以上结果表明:JAK2/STAT5信号通路介导了Pro-Gly促进IGF-1表达与分泌的作用.　　在上述试验中还发现:Pro-Gly可以显著上调小鼠肝脏和HepG2细胞中寡肽转运蛋白PepT1的mRNA表达水平(P＜0.05).为了验证Pro-Gly是否通过PepT1发挥作用,试验选用siRNA对HepG2细胞进行PepT1干扰,结果发现,PepT1 siRNA和0.5 mM的Pro-Gly处理HepG2细胞24 h后,JAK2、STAT5的磷酸化水平和IGF-1的蛋白表达被显著抑制(P＜0.05),Pro-Gly不再发挥促进IGF-1蛋白表达的效应(P＞0.05).以上结果表明:Pro-Gly通过JAK2/STAT5通路调控HepG2细胞IGF-1表达的作用依赖于PepT1.　　综上所述,本研究发现Pro-Gly二肽能够促进肝脏IGF-1的表达与分泌,其机制是通过激活PepT1、升高JAK2/STAT5信号通路的活性,最终促进IGF-1的表达与分泌.该研究结果为深入认识Pro-Gly二肽调控肝脏IGF-1表达与分泌的分子营养学机制提供了试验依据,也为进一步研发促进动物生长发育的营养调控技术提供了新的思路.

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