调控茶树茸毛形成CsTTG1基因表达特征分析

摘要

茶树嫩梢上的茸毛是茶树的一种优良特性。茸毛含有丰富的氨基酸、茶多酚、咖啡碱、黄酮类物质等成分赋予了茶叶更多保健功效及多样性的口感，如苦味、涩味和甜味。目前国内外对茶树茸毛的研究仅停留在生化特性和抗性上，没有对调控茶树茸毛的相关基因进行深入研究，主要集中在拟南芥、甘蓝型油菜等植物中，因此探讨调控茶树茸毛形成发育的分子机理，对开展茶树育种有着深远的意义。　　本研究利用前期的转录组数据，获得WD40转录因子（CsTTG1），为鉴定CsTTG1与茸毛生长发育的线性关系，通过构建过表达载体pBI121-CsTTG1转化到拟南芥与烟草模式植物中，对CsTTG1进行基因功能验证，得出以下结果：　　（1）CsTTG1基因全长是1380bp，有9段开放阅读框，其中长度最长是1029bp。分析茶树基因CsTTG1的生物信息学，将拟南芥、苹果、甘蓝等12个物种中同源基因TTG1与茶树中转录因子TTG1放在一起进行构建进化树，从中找到与NtTTG1高度同源，提示茶树中CsTTG1可能与烟草中同源基因NtTTG1一样参与调控表皮表的生长发育。　　（2）对茶树基因CsTTG1进行荧光定量PCR表达特征分析，结果表明，CsTTG1在茶树新梢和老叶中皆有特异性表达。在茶树茸毛较多的品系中CsTTG1表达量较高，茸毛较少品系CsTTG1表达量较少；在同个茶树品系不同生长部位中转录因子CsTTG1表达量与茸毛分布密度呈线性关系，即顶芽、展开叶表达量较高，而老叶表达量较少。　　（3）将目标基因CsTTG1与载体质粒pBI121 重组，通过菌落验证，抗性筛选和验证，成功构建了茶树CsTTG1基因的过表达载体pBI121- CsTTG1 ，并转导到农杆菌GV1301中。　　（4）在农杆菌GV1301介导下，通过“蘸花法”将过表达载体pBI121-CsTTG1体外转拟南芥中，通过抗性培养基中生根并移栽下地，得到转基因拟南芥植株。提取转拟南芥植株DNA，进行PCR检测，同时进行利用荧光定量PCR分析，发现阳性植株CsTTG1基因表达量较空白对照组基因高度表达。通过体式显微镜对转CsTTG1表现型进行观察，结果发现表皮毛数量较空白对照组增加，同时茸毛增加程度与CsTTG1转录水平的增加呈现正相关，说明CsTTG1正调控茸毛形成。　　（5）在农杆菌GV1301的介导下，将过表达载体pBI121-CsTTG1 转入到无菌烟草中，经过一系列抗性培养基的筛选、诱导分化、生根，最后移栽下地，获取阳性烟草植株。利用RT-PCR分析，发现在转CsTTG1在2棵转烟草中高度表达，但是表皮毛无明显改变，由于表观个体存在差异，无法说明过表达CsTTG1增加烟草表皮毛数量，是否还有其他基因参与更好调控茸毛生长发育还需进一步研究。

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