秃杉除草活性、有效成分及作用机理研究

摘要

秃杉（Taiwania flousiana Gaussen）属于杉科（Taxodiaceae）台湾杉属（Taiwania）。本文以秃杉茎皮为试验材料，采用水蒸气蒸馏得到精油，采用气-质联用法（GC-MS）对秃杉茎皮精油化学成分进行了分析，以水绵（Spirogyra communis(Hass.) Kutz.）为对象研究了其活性及机理。用甲醇提取秃杉茎皮得到甲醇粗提物，利用硅胶柱层析技术和活性跟踪法对秃杉茎皮中具有除草活性的化合物进行分离与鉴定并进行了其作用机理研究。主要研究结果如下：　　采用GC-MS对秃杉茎皮精油的化学成分进行分析，共分离鉴定出36个化合物，主要包括烷烃、酚类、萜类和有机酸。主要化学成分有：9-甲基 -十九烷(17.97%)、二十九烷烃(15.42%)、维生素E(12.63%)、二十四烷烃( 10.51%)、4-[（2-氯-6-氟苄基）硫基]-1,3,5-三嗪-2-胺(8.13%)、8-表苯氧乙酰氧化物(6.00%)、铁锈醇(3.94%)、8-庚基-十五烷( 3.10%)、3-（3,4-二甲氧基苯基）-7-羟基苯并吡喃-2-酮(3.10%)、α-生育酚(2.98%)、2,3,5,6-四氢 3,3,4,5,5,8 六甲基二环戊二烯并苯-1,7-二酮(2.42%)、1,2,3,4,6,8α 六氢-1-异丙基-4,7-二甲基(1.68%)和邻苯二甲酸二丁酯(1.43%)。通过测定叶绿素含量来研究精油对水绵的抑制作用。秃杉精油对水绵叶绿素 a 在 24、48、72和96 h时的抑制中浓度（IC50）值分别是90.10、47.13、41.89和52.29 mg·L-1。通过透射电镜（Transmission Electron Microscope，TEM）分析处理过的水绵细胞，发现高浓度的精油（200 mg·L-1）可破坏细胞壁和叶绿体，使细胞出现空泡化，细胞内仅存细胞器的残核。说明秃杉精油对水绵细胞作用的位点可能主要是细胞壁和叶绿体。　　不同浓度的秃杉甲醇提取物对胜红蓟（Ageratum conyzoides L）、薇甘菊（Mikania micrantha Kunth）、三叶鬼针草（Bidens pilosa L.）、牛筋草（Eleusine indica（L.) Gaertn.）、稗草（Echinochloa crusgalli(L.) Beauv.）、马唐（Digitaria sanguinalis(L. ) Scop.）等杂草和水生植物大薸（Pistia stratiotes）、浮萍（Lemna minor）、水绵以及模式生物拟南芥（Arabidopsis thaliala(L.) Heynh）等供试植物均有抑制作用且抑制率与处理浓度呈正相关。处理 7d 后，胜红蓟、薇甘菊、马唐、三叶鬼针草、牛筋草和拟南芥的根长抑制率IC50值分别是3.14、4.25、4.80、29.53、58.20和158.73 mg·L-1。对胜红蓟、薇甘菊、马唐、三叶鬼针草、牛筋草和拟南芥的鲜重抑制率IC50值分别是3.74、4.33、61.66、41.16、45.67和174.81 mg·L-1。对大薸根的IC50为19.29 mg·L?1，对大薸鲜重的IC50为15.96mg·L?1，叶片校正死亡率的IC50为510.04mg·L?1（7 d）和261.00mg·L?1（12 d）。对浮萍和水绵的叶绿素a的IC50分别为9.13和11.70mg·L?1。　　利用小杯法对不同溶剂对甲醇粗提物的萃取物生物测定结果表明：只有乙酸乙酯萃取物具有高除草活性。处理 7d 后，乙酸乙酯萃取物显著抑制胜红蓟、薇甘菊、三叶鬼针草和牛筋草的根长和鲜重增加，其根长的 IC50值分别是 0.87、3.13、24.79 和47.92 mg·L-1，其鲜重的IC50值分别是3.41、1.07、33.64和32.66 mg·L-1。为了从秃杉中分离到具有高除草活性的化合物，本研究选择乙酸乙酯萃取物进一步分离。从秃杉茎皮中分离得到15个化合物，分别鉴定为新化合物TSC-3、赛菊芋黄素（helioxanthi）、taiwanin E、taiwanin H、1,13,14-trihydroxy-8,11,13-podocarpatrien-7-one、二叶草素（diphyllin）、justicidin A、7β-acetoxy-6β-hydroxyroyleanone、8,11,13-abietatriene-7,11,12,14-tetrol、6β,7a-diacetoxyroyleanone、taiwanin A、3β,14-dihydroxy-13-methoxy-8,11,13-podocarpatrien-7-one、4-hydroxy-3-methoxy-3',4'-methylenedioxy-9,9'-lignanolide、4-cadinene-3,10-diol和4-muurolene-3, 10-diol。　　TSC-3、草甘膦（Glyphosate）和小檗碱(Berberine)处理三叶鬼针草7 d后，对三叶鬼针草根长的 IC50值分别是 0.83、1.35 和 4.56 mg·L-1，对三叶鬼针草鲜重的 IC50值分别是1.14、11.57和7.69 mg·L-1；14 d后，TSC-3与草甘膦、小檗碱对三叶鬼针草根长的IC50值分别是1.13、2.07和4.32 mg·L-1，鲜重的IC50值分别是2.01、4.96和4.60mg·L-1。TSC-3、草甘膦和小檗碱处理胜红蓟7 d后，对胜红蓟根长的IC50值分别是0.29、0.38和2.07 mg·L-1，对胜红蓟鲜重的IC50值分别是0.80、2.28和2.55 mg·L-1。TSC-3、草甘膦和小檗碱处理薇甘菊7 d后，对薇甘菊根长的IC50值分别是0.18、0.87和1.68 mg·L-1，对薇甘菊鲜重的IC50值分别是0.82、2.34和4.72 mg·L-1。TSC-3、Taiwanin E、Taiwanin H、草甘膦和小檗碱处理拟南芥7 d后，对拟南芥根长的IC50值分别是0.63、1.41、16.36、0.11和0.21 mg·L-1，对拟南芥鲜重的IC50值分别是2.80、3.55、18.19、2.44和4.89 mg·L-1。可以看出，TSC-3对胜红蓟、薇甘菊、三叶鬼针草和拟南芥的室内除草活性比草甘膦和小檗碱效果显著。　　由于 TSC-3 具有比草甘膦和小檗碱更强的室内生物活性，因此，研究 TSC-3 的吸收传导相关特性，对TSC-3的田间应用具有重要的指导意义。以10 mg·L-1的TSC-3通过水培和涂叶等不同施药方式处理4-6叶期的薇甘菊幼苗，结果发现两种方法处理的植株都被显著抑制，7 d后根长、根鲜重和整株鲜重明显被抑制，但涂叶处理没有水培处理的效果明显。采用水培法和叶片涂药法研究TSC-3在薇甘菊植株内的传导，通过高效液相色谱法（HPLC）分析，10 mg·L-1的TSC-3水培薇甘菊幼苗0.5、1、2、3、5和7 d后，根中TSC-3浓度分别为519.42、20.38、22.12、24.95、17.27和5.04μg·g-1，下部茎中TSC-3浓度分别为0、25.44、8.78、5.34、0.56和0.26μg·g-1，上部茎中TSC-3浓度分别为0、11.41、5.99、0、0和0μg·g-1，下部叶中TSC-3浓度分别为0、7.57、4.20、1.27、0和0μg·g-1，上部叶中TSC-3浓度分别为0、7.48、3.79、0、0 和 0 μg·g-1。随着时间的延长，在根、茎、叶中均能检测到 TSC-3；叶片涂药处理0.5、1、2、3、5和7 d后，在上部叶片中，0.5、1、2、3、5和7 d后的TSC-3含量分别为 0、9.88、10.13、0.94、0.40和0.14μg·g-1，在下部叶片中，0.5、1、2、3、5和7 d后的TSC-3含量分别为0、4.16、4.43、0.51、0和0μg·g-1，在上部茎中， 0.5、1、2、3、5和7 d后的TSC-3含量分别为0、2.00、0.20、0.14、0和0μg·g-1，在下部茎中，0.5、1、2、3、5和7 d后的TSC-3含量分别为0、0.17、1.31、2.67、0.98和0μg·g-1，在根中，0.5、1、2、3、5和7 d后的TSC-3含量分别为0、2.13、5.92、4.58、1.15和0μg·g-1。这些结果表明，TSC-3可以通过植物的根部吸收并进行向上输导；也可通过植物的叶部吸收并进行向下输导，因此可知TSC-3在植株中具有双向输导性。盆栽实验结果表明：10mg·L-1TSC-3在处理后7 d，对胜红蓟和薇甘菊的鲜重防效达到100%。　　除草机理研究表明， TSC-3 影响了植物生长素在根尖的分布，随着处理时间的增加，根尖生长素逐渐扩散至中柱及皮层，根尖生长素相对高浓度的状态丧失，破坏了生长素的正常的浓度梯度分布。引起了PIN1在根尖的分布情况发生了变化，使PIN1从中柱向皮层扩散，最后扩散到整个根尖；引起了 PIN2 在根尖的分布情况发生了变化，处理后，PIN2 逐渐由皮层向中柱扩散，最后扩散到整个根尖；影响了 AUX1 在根尖的分布，AUX1逐渐向整个根尖扩散，从而影响了生长素在根尖的输入。破坏了微管之间的聚合和稳定性，造成了微管蛋白阵列的畸变；造成根尖静止中心（QC）和分生区氧化还原电位降低，伸长区氧化还原电位升高。

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