“华夏3号”大豆胰蛋白酶抑制剂的分离纯化和钝化影响因素的研究

摘要

“华夏3号”大豆（HX3）是优质的新品种大豆，而其中的抗营养因子，如胰蛋白酶抑制剂（Trypsin inhibitor, TI），会减弱大豆的营养价值。目前对HX3的胰蛋白酶抑制剂（HX3 TI）的研究还没有相关报道，因此本研究以HX3 TI为研究对象，对其展开研究。　　首先，利用硫酸抽提对HX3 TI进行粗分离，一步盐析的回收率为（26.98±0.00）%，纯化倍数为（3.31±0.08）倍；两步盐析的回收率则为（26.05±0.12）%，其纯化倍数为（3.25±0.04）倍。从综合资源节约方面的考虑，本研究将采用0~45%硫酸铵浓度对HX3 TI进行盐析初步纯化。　　采用四种层析柱法对HX3 TI盐析液进一步纯化：（1）DEAE-52柱层析分离纯化， HX3 TI纯化倍数为3.60倍。（2）Sephadex G-75柱层析分离纯化，HX3 TI纯化倍数为3.14倍。（3）Sephadex G-75和DEAE-52柱层析相结合分离纯化，纯化倍数为5.26倍。（4）DEAE-52和Sephadex G-75柱层析相结合分离纯化，纯化倍数为7.30倍。实验数据表明，两步纯化更有优势，其中纯化效果最佳的为DEAE-52和Sephadex G-75柱层析相结合法。　　通过三种电泳方法即PAGE、明胶-PAGE和SDS-PAGE，对纯化倍数最高的HX3 TI进行电泳检测：（1）PAGE电泳检测表明，HX3 TI盐析液泳道有较多的杂蛋白；纯化样品泳道仅有一条电泳带，说明纯化HX3 TI的效果显著，无杂蛋白条带。（2）明胶-PAG E电泳专一性检测胰蛋白酶抑制剂活性，盐析液泳道显示有5条带，说明H X3 TI种类有5种，其中电泳带宽且染色较深，说明HX3 TI的活性高。柱层析纯化样品泳道只出现一条带，说明纯化的HX3 TI只有一种。（3）SDS-PAGE电泳检测得到HX3 TI的分子量在20 kDa左右。　　接着对HX3 TI的钝化作用影响因素进行探讨。在金属离子浓度为0.8mol/L和100℃加热15 min的条件下：加入CaCl2后HX3 TI活性与NaCl、AlCl3相比，分别降低了13.28%和11.49%，其残留率也分别降低了13.28%和11.47%，表明金属离子对HX3 TI的钝化作用有较大的影响，且Ca2+对HX3 TI钝化作用的影响更加明显。在0~0.5 mol/L CaCl2作用条件下，HX3 TI残留率呈U型变化，其中0.2mol/L CaCl2对HX3 TI的作用效果最佳，残留率仅为未加CaCl2的27.04%。进一步通过阿伦尼乌斯方程对HX3 TI的失活能进行分析，表明CaCl2使HX3 TI钝化符合y= b1 e-b2x+（1-b1）e-b3x方程，且失活能为104.15 kJ/mol，未加CaCl2失活能为150.61 kJ/mol，加CaCl2比未加CaCl2需要的能量降低了46.46 kJ/mol。因此，Ca2+明显降低了HX3 TI失活所需要的能量，达到快速钝化HX3 TI的效果。　　进一步探讨碱性蛋白酶钝化HX3 TI的影响因素。（1）单因素实验最佳影响条件分别是：pH10、65℃、50 U/mL酶用量和5 h作用时间。（2）正交试验L9（43）探讨中各因素的主次影响顺序为:酶用量＞温度＞pH＞作用时间。最佳钝化条件为:75 U/mL酶用量、65℃、pH9、5 h作用时间，HX3 TI的残留率为0.5%。（3）响应面分析最佳的钝化条件为:69.01 U/mL酶用量、65.59℃、pH9.56、6.21h作用时间，HX3 TI残留率最低，为0.33%。（4）响应面分析中，HX3 TI残留率比市售大豆TI降低10.58%，说明HX3 TI比市售大豆TI更易钝化。

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