美澳型核果褐腐病菌活性检测研究

摘要

美澳型核果褐腐病菌[Monilinia fructicola(Winter) Honey]是一种重要世界性病原菌，广泛存在于欧洲、亚洲、南美洲，累计造成数亿美元的经济损失。该菌在我国的野生寄主繁多，苹果、梨等仁果类果树和桃、梅等核果类果树都能被侵染，而且我国气候也适宜该病原菌生长，一旦传入，容易定植。该病原菌常于水果储藏期发病，故容易通过贸易人为传播，在近些年水果入境检疫中，曾多次被检出，说明该菌入侵我国的风险很大，因此我国把该菌列为重要的检疫性有害生物。针对该病原菌的国内外研究多集中在分子生物学和形态学鉴定、抗药性检测和综合防治，尚未见有关于该病菌活性判别的报道，针对该检疫性真菌，建立一种快速、准确、可靠的活性检测方法有助于降低该病菌的传入风险。因此，本论文开展了美澳型核果褐腐病菌活性检测技术研究，获得如下结果：　　1. 以美澳型核果褐腐病菌纯培养条件下产生的分生孢子为试验材料，配制孢子悬浮液，以100℃水浴15 min条件下进行灭活；用10种活性染料分别对灭活及活孢子进行荧光染色，以荧光显微镜下观察灭活及活孢子染色结果有明显区别为标准进行筛选，筛选出碘化丙啶（PI）和二乙酰荧光素（FDA）为最佳染料。　　2. 对FDA和PI分别设置的5种浓度和5种染色时间不同组合的染色效果比较，优化出PI最佳染色条件为浓度0.05 mg/mL下室温避光染色4 min、FDA最佳染色条件为浓度0.5 mg/mL下室温避光染色16 min。　　3.分别以5种温度（40℃，45℃，50℃，55℃，60℃）和5个时间（1 min，5 min， 10 min，20 min，30 min）的不同组合处理分生孢子，在FDA和PI最佳染色条件下检测分生孢子活性并测定分生孢子萌发率。结果表明，不同处理的孢子显色比例不能与孢子萌发率匹配，即在一些处理条件下（50℃处理20 min，55℃处理10 min），孢子萌发试验结果显示孢子全部死亡，但该条件下孢子的染色试验结果显示部分孢子具有活性（两个条件下FDA染色率分别是84.89%，91.44%）。试验结果表明，在判断孢子是否具有活性方面，染色法比孢子萌发法更加准确，是因为孢子萌发极易受处理温度胁迫影响而钝化从而大幅度降低其萌发率，但未失去活性，致使孢子萌发法与染色法结果不匹配。　　4. 鉴于FDA只对活孢子显色而PI仅对灭活孢子显色，有助于两染色技术相互验证和提高活性检测精准性，基于以上基础，本论文建立了PI-FD A复染技术体系。　　本论文初步建立了基于PI-FD A复染法和激光共聚焦扫描显微镜的美澳型核果褐腐病菌活性检测技术体系，不仅对分生孢子活性状态有更加准确的检测，而且检测时间由之前孢子萌发试验需要2到3 d减到1h，既可直接用于口岸的美澳型核果褐腐病菌检疫，也可为其它植物病原真菌活性检测提供参考。

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