中国核果/仁果类果树褐腐病菌种群结构及Cyt b基因的遗传进化研究

摘要

我国目前的褐腐病研究工作主要针对桃褐腐病，而对其它果树褐腐病却鲜有报道。本研究对我国桃、李、杏、樱桃、苹果及梨等作物的褐腐病进行了系统研究，同时对细胞色素b（Cytb）基因的遗传进化进行了研究，取得的主要结果如下:
　　(1)从桃、李、杏、樱桃、苹果及梨等寄主上共采集分离到909株褐腐病菌株。对其进行生物学特性观察、ITS序列分析及多重PCR分子鉴定。结果表明:在苹果和梨上分别发现1个新记录种M.yunnanensis，在樱桃上发现2个新记录种，分别为M.fructicola和M.mumecola，在李和杏上都分别发现了3个新记录种，M.fructicola，M.mumecol及M.yunnanensis。我国的褐腐病菌种群主要由M.fructicola，M.mumecola及M.yunnanensis组成。其中，M.fructicola为我国优势种，广泛分布于全国各地，M.mumecola主要分布于湖北、重庆等中西部地区，M.yunnanensis主要分布于云南，为该地区褐腐病菌优势种。同时在陕西和北京等地也发现存在该真菌。
　　(2)基于甘油醛-3-磷酸脱氢酶(G3PDH)及β-微管蛋白序列的系统分析发现不同寄主来源的褐腐病菌主要根据不同的种进行聚类，而跟其寄主来源及地理环境没有显著关系。预示褐腐病菌种群的遗传进化过程中，寄主及地理环境条件并没有起重要的作用。
　　(3) Cytb基因为甲氧基丙烯酸酯类呼吸抑制剂(QoIs)的靶标基因，该基因的突变为病原菌产生对QoI类杀菌剂抗性的主要原因。褐腐病菌Cytb基因含有数量较多的大型内含子，尤其是桃褐腐病菌M.mumecola线粒体含有目前为止已知的最大的Cytb基因。为了解其形成原因，本研究对Cytb的遗传进化进行了系统分析。研究发现包括褐腐病菌在内的真核生物的Cytb基因均起源于α变形菌纲细菌，当Cytb基因进入真核生物后随寄主生物共同进化。在进化过程中，Cyt b基因可以发生跨界水平转移。对Cyt b基因内含子的遗传分析表明，所有内含子都是真核生物获取细菌Cyt b基因后方才产生，Cyt b基因的内含子在不同生物中呈偏向分布。同时，Cyt b基因的内含子主要发现于真菌界及低等植物中，在原生动物界、澡菌界及动物界中则十分罕见。在真菌Cyt b基因中，内含子主要呈补丁状分布，即内含子对不同位点具有明显的偏好性。在进化过程中，Cyt b基因内含子可以通过转座的方式发生较频繁的获得与丢失，虽然此类事件并不一定都对其寄主生物体有益。正是由于褐腐病菌Cyt b基因在进化过程中发生了频繁的内含子获得事件，其中包括基因的水平转移，才使其成为含有最多最大内含子的基因。

目录

声明

摘要

缩略词表

第一章 前言

1．1 褐腐病研究

1．1．1 褐腐病病原菌及造成的危害

1．1．2 我国褐腐病菌种群及分布

1．1．3 我国褐腐菌的形态特征

1．1．4 我国褐腐菌种群的分子鉴定

1．1．5 褐腐病的防治

1．1．6 褐腐病菌种群研究现状

1．1．7 褐腐病菌抗药性研究进展

1．2 线粒体Cyt 6基因研究

1．2．1 线粒体概述

1．2．2 线粒体Cyt b基因的功能与结构

1．2．3 Cyt b基因内含子

1．2．4 Cyt b基因在系统进化分析中的应用

1．2．5 Cyt 6基因的水平转移

1．3 本项目的研究意义

第二章 中国李子褐腐病三个新记录种的鉴定与描述

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 供试菌株

2．2．2 主要实验仪器

2．2．3 主要试剂及耗材

2．2．4 相关培养基

2．2．5 样本单孢分离

2．2．6 菌株的活化

2．2．7 菌落形态观察及生长速率测定

2．2．8 子座形态观察

2．2．9 致病性测定

2．2．10 分生孢子形态学观测

2．2．11 分生孢子萌发实验

2．2．12 基因组DNA的提取

2．2．13 代表性菌株ITS序列分析

2．2．14 代表性菌株多重PCR分析

2．2．15 G3PDH和TUB2基因片段测序

2．2．16 构建系统进化树

2．3 结果与分析

2．3．1 李褐腐菌株形态学分析

2．3．2 致病性测定以及三种表型菌株接种李子时的形态差异

2．3．3 分生孢子形态、大小及萌发方式

2．3．4 种专化性PCR方法及ITS序列分析鉴定代表性菌株

2．3．5 核腐病菌种群系统进化分析

2．4 讨论

第三章 桃、杏、樱桃、苹果及梨褐腐病调查及新纪录种鉴定

3．1 前言

3．2 材料与方法

3．2．1 实验方法

3．2．2 供试菌株

3．3 结果与分析

3．3．1 西南及中部桃产区褐腐病菌M．fructicola的鉴定

3．3．2 杏褐腐病菌三个新纪录种M．fructicola，M．mumecola和M．yunnanensis的鉴定

3．3．3 苹果及梨褐腐病菌新纪录种M．yunnanensis的鉴定

3．3．4 樱桃褐腐病两个新纪录种M．fructicola和M．mumecola的鉴定

第四章 Cyt b基因的遗传进化研究

4．1 前言

4．2．材料与方法

4．2．1 黄瓜霜霉病菌及稻曲病菌Cyt b基因克隆

4．2．2 Cyt b基因数据收集

4．2．3 Cyt b蛋白保守区域的鉴定

4．2．4 Cyt b基因序列的系统进化分析

4．2．5 变形菌Cyt b基因内含子调查

4．2．6 Cyt b内含子位和相的确定

4．2．7 Cyt b基因内含子系统进化树构建

4．2．8 Cyt b基因内含子的同源性鉴定

4．2．9 Southern杂交检测褐腐病菌及灰葡萄孢Cyt b内含子

4．3 结果与讨论

4．3．1 从黄瓜霜霉病菌中分离Cyt b基因

4．3．2 真核及原核生物体内保守的Cyt b基因蛋白

4．3．3 真核生物的Cyt b基因来源于原核生物

4．3．4 Cyt b基因的水平转移(HGT)

4．3．5 Cyt 6基因内含子的分布特征

4．3．6 真菌Cyt b基因内含子频繁缺失现象

4．3．7 真菌Cyt b基因内含子频繁获得现象

4．3．8 内含子的获得与失去事件可以通过转座进行

4．3．9 内含子的获得能够对生物体的表现型产生深远影响

4．4．10 Cyt b基因内含子在线粒体与寄主生物建立内共生关系后获得

4．4 小结

第五章 全文总结与展望

5．1 全文总结

5．2 未来的研究展望

参考文献

攻读博士学位期间发表的学术论文

致谢