TGEV CN12株自然传代与化学诱变传代的遗传变异及生物特性研究

摘要

猪传染性胃肠炎（ Transmissible gastroenteritis ， TGE ）由猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）感染引起的一种高度接触性肠道传染病。猪传染性胃肠炎病毒可引起各个年龄段的猪发病，其中一周龄仔猪的临床症状最为严重，死亡率极高。而断奶后仔猪感染TGEV的死亡率要比未断奶仔猪感染TGEV的死亡率明显更低，但是断奶后仔猪感染TGEV可造成饲料报酬降低、僵猪等情况，从而给养殖业造成了巨大的经济损失。该病最早于1946年在美国被发现，之后在世界范围内均有该病流行。我国于上世纪50年代发现该病的流行，近年来TGEV也一直在我国流行，近年来不断有新的TGEV毒株被发现，同时发现各毒株之间具有一定的差别。为了预防该病毒对猪场的侵袭，研究该病毒的变异规律并将分离到的野毒株进行疫苗研究并显得尤为重要。　　将本实验室一株命名为CN12株的TGEV毒株在连续传代条件下从120代传代至200代，成功构建了一株TGEV疫苗株。通过TCID50测定，该毒株滴度为107.0/mL。将该连续传代的TGEV CN12株进行外源病毒检测，并进行间接荧光实验和中和抗体实验，在外源病毒检测中未发现相关检测病毒的存在。间接荧光抗体实验中实验组荧光明显，对照组无荧光。中和抗体实验中发现在相同时间条件下实验组细胞无细胞病变，而对照组则出现了明显的细胞病变。以上实验进一步确定了CN 12株为TGEV毒株，且在该毒株中未发现有外源病毒存在。　　将该毒株分别在第135代、200代时进行全基因组测序，这两个代次碱基序列和氨基酸序列与第5代、80代的碱基序列与氨基酸序列进行对比分析。发现TGEV CN12株在长期连续传代的过程中，主要是ORF1基因与S基因的变异为主，并且可以明显看到ORF1基因以碱基替换为主，而S基因则主要以缺失或插入为主。其中ORF1 基因的变异比较稳健，变异幅度较小，相应的氨基酸变异也少。TGEV CN12株的S基因变异幅度较大，且其氨基酸变异大。　　为了扩大疫苗备选株的选择范围，将TGEV CN12株从135代开始使用化学诱变剂甲基磺酸乙酯（EMS）进行化学诱变，在诱变传代65代后成功得到一株新的疫苗株TGEV M株。该毒株滴度可达到106.8/mL。在TGEV M株的外源病毒检测中未发现相关检测病毒的存在。将TGEV M株200代与正常传代的135代进行序列对比发现ORF1中以碱基替换为主，S基因以碱基的缺失或插入为主而ORF3基因的变异则是缺失、插入、替换都存在。在分析中可以发现TGEV M株碱基序列随着病毒代次的增加而有了明显的变化，其中增加了ORF3基因的碱基突变，而正常传代的TGEV CN12株则没有发生ORF3基因的变异。

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1.1 概况

1.2猪传染性胃肠炎病毒培养条件研究

1.3理化性质

1.4分子生物学特征

1.4.1基因组结构特征

1.4.2主要结构蛋白及其功能

1.5 致病机理

1.6 流行病学特点

1.7 临床症状

1.8 病理变化

1.9 检测方法

1.9.1 RT-PCR方法

1.9.2病毒分离与鉴定

1.9.3血清学方法

1.9.4 核酸探针杂交技术

1.9.5免疫电镜法

1.10猪传染性胃肠炎病毒的疫苗研究进展

1.11本研究的目的与意义

2.1.1病毒、细胞与相关试剂

2.1.2分子克隆相关试剂与材料

2.1.3主要仪器设备

2.1.4 PK-15细胞培养

2.1.5病毒传代

2.1.6繁殖条件优化实验

2.1.7病毒总RNA提取

2.1.8全基因组分片段PCR扩增

2.1.10回收产物连接Pmd18-T载体

2.1.11大肠杆菌感受态细胞DH5α的制备

2.1.12连接产物转化感受态细胞

2.1.13 PCR筛选阳性克隆

2.1.14序列测定与比较分析

2.2 实验结果

2.2.1 病毒培养

2.2.2 繁殖条件优化实验结果

2.2.3病毒TCID50测定结果

2.2.4 135代、200代测序结果

2.3讨论与结论

3.1材料与方法

3.1.1 PCR检测相关试剂

3.1.2间接荧光抗体实验与中和抗体实验相关试剂

3.1.3病毒总DNA提取

3.1.4病毒总RNA提取

3.1.5引物的设计与合成

3.1.6 cDNA的合成

3.1.7基因片段的PCR扩增

3.1.8 TGEV CN12株间接荧光抗体检测

3.1.9抗体中和实验

3.2实验结果

3.2.1外源病毒PCR检测结果

3.2.2间接荧光抗体检测结果

3.2.3抗体中和实验结果

4.1材料与方法

4.1.1诱变剂与诱变毒株

4.1.2细胞培养与病毒传代相关试剂

4.1.3分子克隆相关试剂与材料

4.1.4主要仪器设备

4.2病毒培养

4.3病毒RNA提取、基因扩增及全基因测序

4.3.1病毒总RNA提取

4.3.2 cDNA的合成

4.3.3各基因片段PCR扩增

4.3.4 PCR产物回收与纯化

4.3.5回收产物连接Pmd18-T载体

4.3.7连接产物转化感受态细胞

4.3.8 PCR筛选阳性克隆

4.3.9序列测定与比较分析

4.4 诱变剂诱导毒株（TGEV M株）外源病毒检测

4.5实验结果

4.5.1诱变剂诱导毒株（TGEV M株）全基因序列分析

4.5.2诱变剂诱导毒株（TGEV M株）外源病毒检测结果

4.6讨论与结论

致 谢

参考文献