鸭坦布苏病毒(DTMUV)弱毒疫苗的研制及免疫效果评价

摘要

鸭坦布苏病毒病是由鸭坦布苏病毒（Duck Tembusu virus，DTMUV）感染引发的以产蛋率下降、出血性卵巢炎为主要特征的一种急性、烈性传染病。鸭坦布苏病毒病感染以麻鸭最多，其次是樱桃谷鸭，番鸭较少，肉鸭和鹅也有相关报道。近年来，鸭坦布苏病毒病在我国大部分养殖区域流行，给养鸭业造成了严重的经济损失，研制能够有效防控该病的疫苗迫在眉睫。　　本研究对实验室保存的番鸭源ZJSBL01强毒株进行电镜观察鉴定，发现病毒粒子在电镜下呈球形，有囊膜，大小在50 nm左右，其形态大小与报道相符。将ZJSBL01株在DF-1细胞上连续传50代后，分别在DF-1细胞上继续常规传50代和在BHK-21细胞上通过5-FU诱导突变传50代以获得不同代次病毒株。对ZJSBL01株不同代次蚀斑纯化3次后，在BHK-21细胞上进行增殖研究，结果表明，ZJSBL01株不同代次在接毒后48 h均可达最大病毒滴度。　　将ZJSBL01株不同代次进行全基因组测序，结果显示，与亲本毒株相比，常规传代F100代核苷酸突变位点12个，其中导致9个氨基酸位点突变；诱导突变传代F50-50代核苷酸突变位点71个，其中导致20个氨基酸位点突变。鸭坦布苏病毒免疫相关的蛋白主要为结构蛋白E蛋白，与亲本毒相比，常规传代F100代E蛋白有2个氨基酸突变，诱导传代F50-50代E蛋白有5个氨基酸突变。表明诱导突变传代方式的核苷酸和氨基酸突变率更高。　　为了确定ZJSBL01株不同代次的安全性和免疫原性，本研究在雏麻鸭上进行动物实验评估，结果显示，F50-40代的安全性和免疫保护力更高，可作为疫苗候选株。进一步对F50-40疫苗候选株的遗传稳定性和安全性研究发现，F50-40在DF-1细胞上传代稳定，对易感麻鸭无毒力返强现象，对产蛋番鸭、产蛋麻鸭具有良好的安全性，接种后鸭群产蛋率维持稳定。同时对 F50-40 疫苗候选株的免疫效力研究发现，对产蛋番鸭、产蛋麻鸭具有良好的免疫原性，ZJSBL01株攻毒后鸭群产蛋率仍维持稳定。　　最后对不同鸭种进行最佳免疫剂量试验，结果显示，樱桃谷鸭可获得免疫保护的最佳免疫剂量为5×104 TCID50/只，麻鸭为3×104 TCID50/只，番鸭为5×104 TCID50/只，与番鸭相比，麻鸭和樱桃谷鸭在最佳免疫剂量下可获得免疫保护时间较长。将F50-40以不同免疫剂量和市场上弱毒疫苗同时在产蛋麻鸭上进行免疫效力评估，结果显示，ZJSBL01株攻毒后，F50-40不同免疫剂量组产蛋率均维持稳定，疫苗组产蛋率轻微下降，同时确定了F50-40在产蛋麻鸭上的最佳免疫剂量为5×104 TCID50/只。　　综上所述，本研究首先通过ZJSBL01强毒株在DF-1和BHK-21细胞上传代致弱，对ZJSBL01 株不同代次全基因测序发现 E蛋白有核苷酸和氨基酸突变，进一步动物实验评估ZJSBL01株不同代次的安全性和免疫原性，成功筛选出疫苗候选株F50-40，在对F50-40进行遗传稳定性、安全性、免疫效力等研究后，确定了F50-40对不同鸭种的最佳免疫剂量，同时与市场上鸭坦布苏弱毒疫苗进行对比评估，在相同的免疫剂量下，F50-40 具有更好的免疫保护力，确定了产蛋麻鸭的最佳免疫剂量为 5×104 TCID50/只。

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