PSMB10蛋白与猪瘟病毒NS3蛋白互作及其对猪瘟病毒增殖的影响

摘要

猪瘟（Classical swine fever, CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）引起的一种猪的重大烈性传染性疾病，对世界各国养猪业造成严重的经济损失。CSFV非结构蛋白NS3在CSFV的增殖过程中发挥了重要作用，但目前有关CSFV NS3蛋白与宿主细胞蛋白之间的相互作用关系及互作关系对CSFV增殖的影响机制研究相对较少。　　为了研究CSFV与宿主细胞的相互作用关系，本实验室前期利用酵母双杂交系统筛选获得8个可能与CSFV NS3蛋白存在相互作用的宿主细胞蛋白，在此基础上，本研究选取与细胞抗病毒感染密切相关的免疫蛋白酶体亚基β10（proteasome subunit beta 10, PSMB10）进行进一步的蛋白相互作用功能验证。本研究首先通过共转化酵母试验、免疫共沉淀、GST-pulldown和激光共聚焦试验，确认了宿主细胞蛋白PSMB10与CSFV NS3蛋白之间的相互作用。　　为了研究CSFV与PSMB10蛋白的相互关系，首先用CSFV感染3D4/2细胞，再对感染后的3D4/2细胞中PSMB10的mRNA和蛋白水平进行检测，研究CSFV感染对细胞蛋白PSMB10表达的影响。结果显示，与未感染细胞相比，CSFV感染的细胞中PSMB10的 mRNA和蛋白水平均降低，表明CSFV感染细胞对PSMB10的表达具有抑制作用。为了进一步研究细胞蛋白PSMB10对CSFV增殖的影响，我们将p3×Flag-PSMB10重组质粒转染3D4/2细胞以过表达PSMB10蛋白，将靶向PSMB10基因的shRNA-PSMB10干扰质粒转染3D4/2细胞以抑制PSMB10蛋白的表达，同时分别设立p3×Flag-CMV和shRNA-NC的转染细胞对照，转染后24 h再感染CSFV石门株， qRT-PCR 检测 CSFV 基因拷贝数、IFA 测定 CSFV 的 TCID50。结果表明，过表达PSMB10蛋白对CSFV的增殖有抑制作用，而在细胞中干扰PSMB10基因表达则促进了CSFV的增殖。　　在研究了细胞蛋白PSMB10与CSFV NS3蛋白的相互作用及PSMB10蛋白对CSFV增殖影响的基础上，为了进一步探讨细胞蛋白PSMB10对CSFV增殖影响的分子机制，我们将0 μg、0.5 μg、1 μg、2 μg的p3×Flag-PSMB10质粒分别与2 μg的HA-NS3质粒共转染3D4/2细胞，检测PSMB10蛋白和NS3蛋白的表达情况。结果显示，随着p3×Flag-PSMB10质粒转染量的增加，NS3蛋白的表达量随之下降，表明细胞蛋白PMSB10对CSFV NS3蛋白的表达具有抑制作用。鉴于PSMB10是免疫蛋白酶体的一个亚基并参与泛素-蛋白酶体途径，为了解PSMB10蛋白是否通过泛素-蛋白酶体途径降解NS3蛋白从而对NS3蛋白产生抑制作用，我们再将HA-NS3质粒转染3D4/2细胞，转染后24 h用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞，同时设立HA-NS3质粒转染并用DMSO处理的细胞对照，免疫沉淀方法检测NS3蛋白是否被泛素化。结果显示，转染并用MG132处理的细胞能检测到泛素蛋白的表达，而用DMSO处理的转染细胞未见泛素蛋白的表达，表明CSFV NS3蛋白在3D4/2细胞中被泛素化。综上，细胞蛋白 PSMB10 对 NS3 蛋白的表达具有抑制作用，其作用可能与泛素-蛋白酶体途径对NS3蛋白的泛素化修饰和降解有关。　　为了进一步研究PSMB10是否通过MHC-I类抗原递呈途径抑制CSFV的增殖，我们分别检测了CSFV感染、p3×Flag-PSMB10重组质粒转染以及shRNA-PSMB10干扰质粒转染的3D4/2细胞MHC-I类抗原递呈途径转运相关分子TAP（TAP1、TAP2、Tapasin）的 mRNA 表达水平。结果表明，CSFV 感染 3D4/2 细胞对 TAP1、TAP2、Tapasin的mRNA表达有抑制作用，PSMB10对TAP1、TAP2、Tapasin的mRNA表达有促进作用。接着我们将p3×Flag-PSMB10质粒转染3D4/2细胞，24 h后用CSFV石门株感染转染的细胞，分别设立 p3×Flag-CMV 转染后再感染 CSFV 的细胞对照和空白细胞对照，Western blot检测TAP1、TAP2、Tapasin蛋白在细胞中的表达情况。结果显示，与 p3×Flag-CMV 转染后再感染 CSFV 的细胞对照相比， 转染 p3×Flag-PSMB10质粒后再感染CSFV的细胞TAP1、TAP2、Tapasin蛋白表达量均显著上升，其中TAP1、TAP2的蛋白表达量超过空白细胞对照，表明CSFV感染3D4/2细胞可抑制TAP1、TAP2、Tapasin蛋白的表达，PSMB10蛋白则可恢复甚至增强CSFV感染的细胞TAP1、TAP2、Tapasin蛋白的表达水平。　　综上所述，本研究证明了细胞蛋白PSMB10与CSFV NS3蛋白以及CSFV的增殖存在相互作用关系，为研究宿主细胞抗CSFV的感染机制提供了一定的理论基础。

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