MAPK信号途径与自噬在甘蔗鞭黑粉菌有性配合与菌丝生长过程中的功能研究

摘要

甘蔗鞭黑穗病（Sugarcane smut）是一种由孢堆黑粉菌属的甘蔗鞭黑粉菌（Sporisorium scitamineum）引起的重要病害，对我国乃至世界的糖产业均是一个巨大的威胁。研究病原菌的分子生物学特性可为明确致病机制、制定防控策略等提供理论依据，但对于甘蔗鞭黑粉菌迄今人们还知之甚少，亟待加强研究。为给甘蔗鞭黑粉菌分子生物学特性增加资料，本论文对甘蔗鞭黑粉菌自噬基因SsATG8和MAPK信号途径关键基因SsKPP2进行了近三年的研究，获得了如下主要结果：　　1. 通过白色念珠菌（Candida albicans）的MAPK信号途径激酶Cek1序列在甘蔗鞭黑粉菌基因组进行同源比对，寻找到MAP Kinase编码基因的同源基因，根据注释命名为SsKPP2，与其他MAPK蛋白SrKpp22、UmKpp2、UhKpp2、PsMAPK1、MgPmk1、ScFus3和SpSpk1有相同的结构域，这些MAPK信号途径激酶都拥有一个TXYmotif作为激活位点。　　2. 采用 PEG 介导的原生质体转化对 SsKPP2 进行敲除，通过有性配合试验，发现SsKPP2缺失突变体与野生型间的配合减弱，突变体之间不配合，表明SsKPP2参与调控甘蔗鞭黑粉菌有性配合。外源添加cAMP时，突变体与野生型的配合恢复，突变体间也出现了配合现象，说明甘蔗鞭黑粉菌的有性配合同时受到 cAMP/PKA 与MAPK信号途径调控且两者功能部分重叠。白色念珠菌中已知的信号分子色醇则可以在0.02 mmol/L的低浓度恢复野生型与突变体间的有性配合，但对突变体间的配合无影响，说明色醇可以促进有性配合且可能受SsKPP2信号传导通路调控。0.2 mmol/L的较高浓度色醇表现出了对有性配合的抑制作用。在液体振荡培养试验中， SsKPP2敲除突变体生长慢于野生型，加入色醇（0.02 mmol/L）时，突变体的生长受到抑制，提示SsKPP2也通过调控色醇合成与代谢而调控甘蔗鞭黑粉菌的生长。　　3. 通过酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的自噬关键蛋白Atg8序列在甘蔗鞭黑粉菌基因组进行同源比对，寻找到ATG8基因的同源基因，命名为SsATG8；多重序列比对发现玉米丝黑穗菌（Sporisorium reilianum）、玉米瘤黑粉菌（Ustilago maydis）、大麦坚黑粉菌（Ustilago hordei）、酿酒酵母（S.cerevisiae）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、致病疫霉（Phytophthora infestans）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、大白鼠（Rattus norvegicus）等真核生物的的Atg8序列高度保守，在其C端均有一个保守的甘氨酸。　　4. 采用 PEG 介导的原生质体转化对 SsATG8 进行敲除，有性配合和液体振荡培养试验结果表明SsATG8的缺失对甘蔗鞭黑粉菌的有性配合和生长无显著影响；但固体培养7 天，SsATG8缺失突变体菌落边缘则有假菌丝形成，显微观察发现其突变体的菌体畸形、芽殖后细胞不分离，表明SsATG8参与甘蔗鞭黑粉菌的形态发生；在抗逆性试验中，SsATG8缺失突变体在MM-N培养基上生长受到阻碍，加1 mmol/L的H2O2则不能生长，表明自噬对甘蔗鞭黑粉菌的抗逆性有着重要的作用。

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