室内小型猪粪厌氧发酵模型中微生物耐药基因对外源铜添加的响应

摘要

随着农业结构的调整和产业化的推进，畜牧业养殖规模向着集约化和规模化高速发展。但养殖水平提高的同时，畜禽生产过程排放大量废弃物极度消耗了环境对污染物的处理能力。除了环境中残留抗生素对耐药基因有直接选择作用，重金属也能够协同选择耐药基因，导致微生物群落中多重抗性菌的产生。厌氧发酵作为一种被广泛使用的废水污物处理方式，有良好的有机成分消解和有毒有害成分去除作用，能比较明显的降低耐药基因的相对丰度。但在一些实验中发现，某些特定的耐药基因会在厌氧发酵过程末期发生丰度的回升。　　为了探究铜对厌氧发酵的影响，本实验在以猪粪为发酵物的实验室厌氧发酵小型体系中添加不同浓度的铜，设置了空白、低浓度(Cu：1.1mg/kg)、中浓度(Cu：11mg/kg)、高浓度(Cu：110mg/kg)。在加入CuCl2溶液后第5h和第6d、第12d、第18d、第25d、第31d、第37d、第46d和第52d天采样。对发酵体系中抗生素抗性基因、整合子基因和重金属抗性基因进行定量，并运用高通量测序分析群落结构多样性，检测发酵后期体系中耐铜菌携带片段情况。　　本实验中共检测了11种基因的相对丰度，其中相对丰度最高为tetO，qnrS相对丰度最低。除了pcoD、tetO和tetT，其他基因之间都存在显著相关性。PcoD和tetT的相对丰度在整个实验过程中的变化规律于不同浓度组之间有显著差异。tetA、tetB、tetO、qnrS、ermA、ermB的相对丰度在发酵后期回升，相对丰度回升幅度在高浓度组中最高。　　实验过程中，在门水平上样品中占比从高到低依次是厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门（Proteobacteria）。厚壁菌门在第18d达到最低占比，变形菌门在第25d达到最高占比，拟杆菌门在第18d达到最高占比。属水平上占比最多为厌氧芽孢杆菌（Clostridium_sensu_stricto_1），占比第二为土孢杆菌属（Terrisporobacter），两种菌属在第18d达到最低占比。占比第三和第四的属种，Proteiniclasticum和Petrimonas，在第18d达到最高占比。　　发酵初期，体系中微生物多样性随着时间显著提高，第18d体系中物种丰富度最高，随后趋于稳定，物种多样性随着时间缓慢减少。发酵初期不同时间的样品间物种多样性差异显著，在第31d后样品间物种多样性差异不显著。棒杆菌属（Corynebacterium_1）和链球菌属（Streptococcus）同tcrB、intl1、intl2、ermA、ermB、tetA和tetB存在显著正相关（R＞0，p＜0.05）。Clostridium_sensu_stricto_1、土孢杆属（Terrisporobacter）和Turicibacter同tetT存在显著正相关（R＞0.3，p＜0.05）。　　从空白组、中浓度组和高浓度组第25d、31d和47d样品中筛选出90株铜抗性菌。在这些菌中，intl1检出率最高，intl2、tetT和tetO检出率为0%，单菌株携带片段种数随时间增多，多片段同时携带的组合中都存在着intl1、ermA和ermB。这三类基因相对丰度同棒杆菌属和链球菌属丰度存在极显著近线性相关。本实验中一类整合子上携带的抗生素抗性基因种类逐渐增多，其中固定携带着ermA和ermB的整合子能够使得宿主菌在发酵后期存活。棒杆菌属和链球菌属可能作为这类整合子的主要宿主，其生命活动导致后期相对丰度回升。　　本实验选取的中、高浓度组的铜浓度不仅在养殖场猪粪中检出范围内，同时也高于环境中铜最低选择浓度，铜抗性基因pcoD的相对丰度在不同浓度组间随时间的显著差异变化也侧面证明了外源铜添加浓度产生了选择压力。耐药基因相对丰度在第18天上升，畜禽粪便中的铜抑制了耐药基因的消解，也促进了耐药基因丰度的升高。规模养殖场畜禽粪便在进行厌氧发酵处理前，应当通过其他工艺减少铜的含量，而进行发酵处理产物应当选择正确的时间外排到周围环境中。

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