广东省园林植物肾形肾状线虫分子特征及分子检测技术的研究

摘要

肾形肾状线虫（Rotylenchulus reniformis）为固着性半内寄生线虫，其寄主范围很广泛，多发生在热带和亚热带地区。最近几年，国际间和省际间园林植物的调运越来越频繁，但也伴随着日益突出的肾形肾状线虫病害问题。本研究对我国园林植物肾形肾状线虫的分子特征进行分析，在此基础上建立了实时荧光定量PCR 和环介导等温扩增两种快速分子检测方法，为检测进出口园林植物上的肾形肾状线虫提供了快速有效的方法。主要研究结果如下：　　1.对来自不同地区 21 个种群肾形肾状线虫核糖体 DNA（rDNA）的内转录间隔区（Internal Transcribed Spacer，ITS）和28S rDNA基因的D2D3区进行测序和分析。序列比对结果显示，我国的肾形肾状线虫rDNA基因与国外报道的类似，也有两种类型，其中 A 型（ typeA ） rDNA-ITS 长度为 996-1104bp ， A 型内序列的相似性为94.2%-100%；B型（typeB）rDNA-ITS长度为1143-1149bp，B型内的序列相似性为93.1%-100%。另外，typeA 28S rDNA-D2D3区长度为780-786bp，typeA内的相似性为95.3%-100%；typeB 28S rDNA-D2D3区长度为780-781bp，typeB内的相似性为95.4%-98.5%。而且，来自于同一条线虫的不同克隆也存在typeA和typeB两种类型。　　2.对来自不同地区21个种群肾形肾状线虫线粒体DNA（mtDNA）的细胞色素氧化酶I（COI）基因进行测序和分析。序列比对结果表明mtDNA-COI区基因保守，所有序列相似性高达99.3%-100%。　　3. 运用贝叶斯法分析了肾形肾状线虫与其它近缘种之间的系统发育关系，结果显示，基于rDNA基因的ITS区和D2D3区序列构建的系统发育进化树，肾形肾状线虫明显分为typeA和typeB 两个进化枝，但mtDNA-COI区进化树显示所有肾形肾状线虫聚成一支。　　4.基于28S rDNA-D2D3区设计了扩增肾形肾状线虫的实时荧光定量PCR特异性引物Rr-28SF/Rr-28SR2，构建了特异性检测肾形肾状线虫的实时荧光定量PCR体系。该体系特异性强，21个种群的肾形肾状线虫均可被检测出来，而对其它植物寄生线虫的DNA模板没有扩增；灵敏性高，循环阈值（threshold cycle, Ct值）为23.19 ± 0.19至29.66 ± 0.07且可检测到1/1000条线虫DNA，是普通PCR灵敏性的100倍，可在实际工作中应用于检测含肾形肾状线虫量少的样本。　　5.基于28S rDNA-D2D3区设计了肾形肾状线虫环介导等温扩增特异性引物组：外引物Rr-F3/Rr-B3和内引物Rr-FIP/Rr-BIP，利用该引物组构建了检测肾形肾状线虫的环介导等温扩增体系。该体系特异性强，通过SYBRGreen I染料法、酶切实验和扩增产物测序均表明其只能特异扩增肾形肾状线虫，不能扩增其它线虫；灵敏性较高，可检测1/100条线虫DNA，是普通PCR灵敏性的10倍。　　本研究建立了两种肾形肾状线虫快速分子检测方法，为园林植物进出口岸检疫部门提供了肾形肾状线虫有效的快速检测手段，对加强园林植物肾状线虫病害诊断具有重要的意义。同时，本研究明确了我国园林植物上肾形肾状线虫的分子特征，为进一步了解肾状属线虫的种内变异提供了重要信息。

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