中国肾形肾状线虫不同地理群体形态、分子及生物学特性研究

摘要

肾形线虫(Rotylenchulus Linford& Oliverira,1940)是一类重要的植物半内寄生性线虫,寄生植物根部,影响根系,特别是须根系的生长,严重的甚至造成根系的坏死,腐烂等症状。属内10种线虫中,肾形肾状线虫(R.reniformis Linford&Oliverira,1940)是该属的模式种,也是分布和寄主范围最为广泛的一类植物寄生线虫,寄主可达300多种,涉及农作物、果树、蔬菜和观赏性植物。因其对棉花、荔枝、凤梨、甘薯等都造成了严重损失,世界上许多国家和地区将肾形肾状线虫列为检疫性对象。本研究对采自我国5省市的33个肾形线虫群体进行了形态学和rDNA分子特征及肾形肾状线虫生物学特性进行了系统的研究,主要研究结果概述如下:
　　 1.通过对我国海南、广东、福建、浙江、重庆5省市植物根围1021份土壤样品的分离和鉴定,总计发现33个肾形线虫群体,经形态学观察及形态测量值的比较,鉴定有关的33个肾形线虫群体均为肾形肾状线虫,表明肾形肾状线虫是我国肾状属的优势种群。其中浙江省和重庆市为首次报道。
　　 2.进一步了解我国肾形肾状线虫群体的寄主情况,本研究中33个肾形肾状线虫群体寄主涉及16科24属植物,其中龙眼为肾形肾状线虫的新寄主。
　　 3.对采集到的肾形肾状线虫群体形态学观察,发现均为两性生殖群体,雌雄虫数量相近。不同群体间未成熟雌虫和雄虫的形态学特征基本一致,除个别群体中的少量虫体尾部末端存在变异现象。通过形态测量值与模式种及已报道群体比较,发现来自中国5省市的肾形肾状线虫群体形态测量值大部分都在该种参考范围之内,但个别群体b值、c值、DGO及透明尾测量值存在一定差异,系种内不同地理群体的差异。通过肾形肾状线虫HN17群体雌雄虫扫描电镜的观察,丰富了肾形。肾状线虫形态学特征。
　　 4.PCR扩增我国肾形肾状线虫群体rDNA ITS区并测序,结合GenBank上的肾形肾状线虫两性生殖群体序列(AY335191、AY335192、FJ374686)和孤雌生殖群体序列(AY335190)比较构建了系统发育树。结果表明:不同地理群体的肾形肾状线虫ITS区扩增片段长度约为800bp。基于rDNA ITS区的PCR-RFLP及序列分析,将本研究中的33个肾形肾状线虫群体分为A、B、C三种类型,其中HN8和HN17为B型,FJ56为C型,其余30个群体均为A型。A型内肾形肾状线虫群体rDNA ITS区序列较稳定,与上述GenBank中的两性生殖群体和孤雌生殖群体序列相似度分别为98.6-100％和90.5-91.1％:B、C型肾形肾状线虫群体序列与A型差异相对较大,相似度为94.0-95.0％,与GenBank中的两性群体序列和孤雌生殖群体序列比较相似度分别为93.7-94.7％和89.9-91.0％,其中B型内HN8和HN17相似度为99.9％,B型与C型相比相似度为94.5-94..7％。结合GenBank上序列构建的肾形肾状线虫不同地理群体的系统进化树,所有肾形肾状线虫群体聚为一类,该类又分为两性生殖与孤雌生殖两个类群;两性生殖群体中A型与GenBank中登录的肾形肾状线虫两性生殖群体聚合在一起,而B、C型聚合在一起,肾形肾状线虫两性生殖群体共形成了三个分支,该结果与肾形肾状线虫ITS区PCR-RFLP结果一致。对ITS区中的ITS1和ITS2序列进行了分别的分析和比对,结果显示:肾形肾状线虫两性生殖群体间rDNA ITS、ITS1及ITS2都存在明显的变异,其中.ITS1较ITS和ITS2变异相对较大,两性生殖群体和孤雌生殖群体序列相似度相对较低。
　　 5.肾形肾状线虫不同地理群体28S RNA基因中D2D3区的PCR扩增及序列分析,结合GenBank中登录的肾形肾状线虫28S RNA基因中D2D3区序列(DQ328713)及R.Macrodoratus28S RNA基因中D2D3区序列(DQ328711)进行比对分析,构建系统进化树。结果表明:不同地理群体的肾形肾状线虫28S RNA基因中D2D3区扩增片段长度约为780bp:我国33个肾形肾状线虫群体与DQ328713比较相似度为98.2-99.8％,其中HN8、HN17和FJ56与DQ328713的相似度为99.1-99.8％以上,而与R.macrodoratus D2D3区序列DQ328711相比较则差异较大,相似度仅为77.1-78.6％;本研究为国际上首次对肾形肾状线虫种内各群体间的28S RNA中D2D3区进行系统进化研究,有关的肾形肾状线虫的分子数据,对该虫的分子鉴定有直接的应用价值。
　　 6.系统研究了我国肾形肾状线虫的生活史及繁殖力。通过对大豆的接种实验,确定了我国肾形肾状线虫在27±2℃条件下,从侵染大豆根部到完成整个生活史需27 d,肾形肾状线虫的繁殖力随接种量的增加而降低。
　　 7.肾形肾状线虫梯度接种烟草、番茄和黄瓜的实验结果显示:在接种量低于50条/盆时,肾形肾状线虫的危害不明显,而接种量为500条/盆以上时,植株地上部和根系统生长都受到影响,接种量为5000条/盆时,植株地上部严重矮化,根系统不发达,须根系很少;肾形肾状线虫在三种寄主上的繁殖情况与接种大豆的趋势相同。
　　 本研究将有助于肾形线虫的形态及分子分类的进一步研究,为了解我国肾形肾状线虫的危害及加强防治提供了参考和依据。