肾形肾状线虫不同地理群体遗传多样性分析

摘要

肾形肾状线虫（Rotylenchulus reniform）是广泛分布于热带和亚热带地区的一种重要的植物半内寄生性线虫，能够寄生棉花、甘薯、凤梨和香蕉等多种蔬菜作物和热带水果，并引起较大的危害。近年来，肾形肾状线虫已经成为美国陆地棉上的一种主要病害，严重影响棉花的产量。据报道肾形肾状线虫在我国部分地区已经成为植物病原线虫优势种之一，可能对我们农作物生产造成严重危害。本研究利用DNA序列分析技术，对来自我国浙江、福建和重庆的3个肾形肾状线虫地理群体间及群体内个体间rDNA序列变异进行了分析;利用qPCR技术分析了不同rDNA类型在基因组中的含量关系;同时利用线粒体DNA分子标记对肾形肾状线虫不同地理群体的遗传多样性及群体间的遗传分化等进行了系统分析。本研究主要内容包括：
　　⑴肾形肾状线虫rDNA内检测出两种rDNA变异类型，标记为变异类型1(RN_ VAR1)和变异类型2（RN_VAR2）。序列比对分析发现肾形肾状线虫rDNA基因中18S、28S和ITS区均出现变异，且ITS区变异较为明显。其中变异类型1的ITS序列长度为705～712bp，GC含量为45.1％～46.7％;变异类型2的ITS序列长度为854～860bp，GC含量为48.4％～50.0％。2种类型ITS一致度（包括5.8S RNA基因）仅为62.1％～65.6％，而各rDNA类型内部各个克隆序列也存在差异。变异类型1内个体间一致度为89.9％～100％;变异类型2内个体间一致度为91.4％～99.8％。2种rDNA变异类型ITS区一致度仅为62.1％～65.6％。系统进化分析表明2种变异序列明显分成2支，与Nyaku2013报道的2种18SRNA基因变异类型相对应。
　　⑶利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR)检测发现RN_VAR1和RN_VAR2含量分别占rDNA重复单位含量的56％和40％。说明这两种rDNA变异类型是肾形肾状线虫rDNA基因组中主要的存在形式。
　　⑶肾形肾状线虫线粒体COⅡ-LrRNA基因的遗传多样性分析表明:肾形肾状线虫线粒体COⅡ-LrRNA基因片段序列为557-563 bp，AT含量为85.5％，明显高于GC含量。序列分析所得3个群体总的变异位点数、单倍型数、单倍型多样性、核苷酸多样性分别为176、40、0.946、0.1574。分子方差分析结果显示这3个肾形肾状线虫群体间遗传分化系数为0.05815，遗传分化程度中等，群体遗传结构较弱。同时遗传变异结果显示，94.18％的变异来自群体内个体间，只有5.82％的变异发生在群体间。总的来说，我国肾形肾状线虫种群内COⅡ-LrRNA基因序列变异较明显，具有丰富的遗传多样性，且对环境变化的适应能力较强，在中国南方地区具有较大的生存空间。

目录

声明

致谢

摘要

第一章 引言

1．1 肾形肾状线虫研究概况

1．2 线虫遗传多样性研究及其技术

1．2．1 基本概述

1．2．2 线虫遗传多样性研究中常用的分子标记技术

1．3 基因组多态性分析在线虫遗传多样性研究中的应用

1．3．1 线虫核糖体DNA在线虫遗传多样性研究中的应用

1．3．2 线虫线粒体DNA在线虫遗传多样性研究中的应用

1．4 本研究的目的和意义

第二章 肾形肾状线虫不同地理群体rDNA基因克隆及遗传变异

2．1 引言

2．2 材料与方法

2．2．1 供试线虫及培养

2．2．2 DNA的提取

2．2．3 PCR扩增

2．2．4 PCR产物的纯化

2．2．5 连接

2．2．6 转化

2．2．7 重组质粒的PCR鉴定

2．2．8 DNA序列测定与分析

2．2．9 基因含量分析

2．3 数据分析

2．4 结果与分析

2．4．1 肾形线虫18S rDNA变异分析

2．4．2 线虫ITS区扩增结果

2．4．3 肾形线虫rDNA-ITS变异分析

2．4．4 肾形线虫28S rDNA变异分析

2．4．5 荧光定量结果

2．5 讨论

第三章 肾形肾状线虫不同地理群体线粒体COⅡ-LrRNA基因克隆及遗传多样性分析

3．1 引言

3．2 材料与方法

3．2．1 供试线虫及培养

3．2．2 DNA的提取

3．2．3 mtDNA COⅡ-LrRNA 基因引物设计

3．2．4 PCR扩增

3．2．5 PCR产物的纯化、连接、转化

3．2．6 序列测定及分析

3．3 数据分析

3．4 结果与分析

3．4．1 肾形线虫线粒体COⅡ-LrRNA基因片段的PCR扩增

3．4．2 肾形线虫线粒体COⅡ-LrRNA基因片段序列特征及变异分析

3．4．3 肾形线虫线粒体COⅡ-LrRNA基因片段区域核苷酸及单倍型多样性分析

3．4．4 肾形线虫各地理群体间的遗传分化和分子方差(AMOVA)分析

3．5 讨论

第四章 全文总结

4．1 结论

4．2 论文创新之处

4．3 本研究需迸一步解决的问题

参考文献

附录