青少期慢性应激大鼠的免疫炎症改变及四逆散干预机制

摘要

目的:　　探讨青少期慢性应激对不同性别大鼠行为学、海马神经元、外周免疫及中枢免疫的影响，及四逆散的干预机制。　　方法:　　4周龄Wistar大鼠雌雄各半，按体重随机分为空白组不接受应激，应激组接受为期21d的慢性不可预见性应激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)，然后应激组再次按体重随机分为模型组、四逆散低剂量组、四逆散高剂量组、氟西汀组，继续予以CUMS法应激，同时各给药组给予相应药物水溶液灌胃，空白组和模型组予生理盐水灌胃，持续21d。末次给药后对各组大鼠检测体重、糖水偏好率、旷场实验;采用苏木精一伊红染色法（hematoxylin-eosin staining，HE染色法）观察各组大鼠海马齿状回(dentate gyrus，DG)区神经元形态;采用默克密理博多因子检测技术(milliplex map)测定血浆和海马促炎性细胞因子肿瘤坏死因子α(tumor necrosisfactorα，TNF-α)、白介素1β(interleukin1β，IL-1β)、白介素6(interleukin6，IL-6)、干扰素γ（interferonγ，IFNγ）和抗炎性细胞因子白介素4(interleukin4，IL4)、白介素10（interleukin10，IL-10）的浓度;使用Western-blotting技术检测海马小胶质细胞活化标志物CD11b及星形胶质细胞活化特征性标记物胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)，以及海马核转录因子κBp65(nuclearfactorκBp65，NF-κ B p65)和磷酸化核转录因子κ B p65(Phospho-NF-κ B p65);用免疫组织化学方法观察各组大鼠海马DG区GFAP表达分布和NF-κ B p65表达分布。当不同性别同组数据资料相近并且组间变化趋势相同时，合并进行统计分析，否则分别按不同性别进行统计分析。　　结果:　　一、四逆散对青少期慢性应激大鼠行为学的影响　　（一）一般状态接受应激前，空白组和应激组大鼠都精神状态良好，毛发整洁光亮，活泼好动，饮食正常。初次应激21d后，应激组大鼠表现出精神紧张，饮食量减少，毛发凌乱、枯黄失泽，灌胃和应激时反应剧烈，易惊并出现弓背防御状态，易激惹。再次应激21d后，模型组大鼠精神萎靡，体型瘦削，毛发凌乱色暗，易于脱落，时常蜷伏角落贴笼壁;四逆散低剂量组、四逆散高剂量组和氟西汀组大鼠均表现活跃，鼠毛整洁有光泽。空白组大鼠各方面状态保持良好。　　（二）体重雄鼠模型组较空白组体重显著降低（P＜0.05），模型组与四逆散低剂量组、四逆散高剂量组、氟西汀组体重比较，均无显著差异（P＞0.05）。雌鼠模型组较空白组体重显著降低（P＜0.05），模型组与四逆散低剂量组、四逆散高剂量组、氟西汀组体重比较，均无显著差异（P＞0.05）。　　（三）糖水偏好实验各组糖水偏好率比较无显著差异（P＞0.05）。　　（四）旷场实验模型组较空白组旷场总路程显著下降（P＜0.05），四逆散低剂量组和氟西汀组均较模型组旷场总路程显著升高（P＜0.05），四逆散高剂量组较模型组旷场总路程升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。　　二、四逆散对青少期慢性应激大鼠海马神经元形态学的影响　　海马DG区HE染色结果雌雄空白组大鼠海马DG区神经元形态清晰，结构正常，排列整齐，层次紧密，细胞核清晰，核仁明显。雄鼠模型组、四逆散低剂量组、四逆散高剂量组、氟西汀组分别与空白组比较，无明显差异。雌鼠模型组神经元数量减少，排列疏松，细胞层变薄;雌鼠四逆散低剂量组、四逆散高剂量组和氟西汀组均较MC组改善，排列紧密，细胞层数增加。　　三、四逆散对青少期慢性应激大鼠外周免疫炎症的影响　　（一）血浆TNF-α雄鼠各组血浆TNF-α浓度比较无显著差异（P＞0.05）。雌鼠模型组较空白组血浆TNF-α浓度显著降低（P＜0.05），四逆散低剂量组、四逆散高剂量组、氟西汀组分别较模型组血浆TNF-α浓度显著升高(P＜0.05)。　　（二）血浆IL-1β各组大鼠血浆IL-1β浓度比较均无显著差异（P＞0.05）。　　（三）血浆IL-6、IFNγ、IL-4和IL-10因表达水平较低，应用此方法基本检测不到。　　四、四逆散对青少期慢性应激大鼠海马免疫炎症的影响　　（一）海马TNF-α雄鼠模型组较空白组海马TNF-α浓度显著降低(P＜0.05)，模型组与四逆散低剂量组、四逆散高剂量组、氟西汀组海马TNF-α浓度比较无显著差异(P＞0.05)。雌鼠各组海马TNF-α浓度比较无显著差异(P＞0.05)。　　（二）海马IL-1β雄鼠模型组较空白组海马IL-1β浓度显著升高（P＜0.05），四逆散低剂量组、四逆散高剂量组均较模型组海马IL-1β浓度显著降低(P＜0.05)，氟西汀组较模型组海马IL-1β降低，但差异无显著性（P＞0.05）。雌鼠各组海马IL-1β浓度比较无显著差异（P＞0.05）。　　（三）海马IL-6模型组较空白组海马IL-6浓度显著升高(P＜0.05)，四逆散低剂量组、四逆散高剂量组均较模型组海马IL-6浓度显著降低（P＜0.05），氟西汀组较模型组海马IL6浓度降低，但差异无显著性（P＞0.05）。　　（四）海马IFNγ模型组较空白组海马IFNγ浓度显著升高（P＜0.05），四逆散低剂量组、四逆散高剂量组、氟西汀组均较模型组海马IFNγ浓度显著降低(P＜0.05)。　　（五）海马IL-4模型组较空白组海马IL-4浓度显著降低（P＜0.05），四逆散低剂量组较模型组海马IL-4浓度显著升高（P＜0.05），四逆散高剂量组、氟西汀组均较模型组海马IL-4浓度升高，但差异无显著性（P＞0.05）。　　（六）海马IL-10雄鼠模型组较空白组海马IL-10浓度显著升高（P＜0.05），四逆散低剂量组、四逆散高剂量组、氟西汀组均较模型组海马IL-10浓度显著降低(P＜0.05)。雌鼠各组海马IL-10浓度比较无显著差异(P＞0.05)。　　（七）海马CD11b相对蛋白量雄鼠各组海马CD11b相对蛋白量比较无显著差异(P＞0.05)。雌鼠模型组较空白组海马CD11b相对蛋白量显著降低（P＜0.05），四逆散低剂量组、四逆散高剂量组均较模型组海马CD11b相对蛋白量显著升高（P＜0.05），氟西汀组与模型组海马CD11b相对蛋白量无显著差异（P＞0.05）。　　（八）1.海马GFAP相对蛋白量雄鼠模型组较空白组海马GFAP相对蛋白量显著降低（P＜0.05），模型组与四逆散低剂量组、四逆散高剂量、氟西汀组海马GFAP相对蛋白量比较均无显著差异（P＞0.05）。雌鼠模型组较空白组海马GFAP相对蛋白量显著升高（P＜0.05），四逆散低剂量组、四逆散高剂量组、氟西汀组均较模型组海马GFAP相对蛋白量显著降低（P＜0.05）。　　2.海马DG区GFAP免疫组化结果镜下可见GFAP在各组大鼠海马DG区均有表达，主要分布在胶质细胞胞浆及突起，呈棕黄色，星形胶质细胞形态呈星形或放射状。雄鼠空白组大鼠海马DG区呈均匀弥漫性染色，有长短不等而粗壮的突起。模型组大鼠海马DG区内GFAP表达下降，阳性细胞数量减少，分布稀疏，突起变短细、染色变浅。四逆散低剂量组、四逆散高剂量组、氟西汀组分别与模型组相比较，无明显差异。雌鼠空白组大鼠海马DG区内GFAP免疫阳性细胞胞体较小，突起纤细。模型组大鼠海马DG区内GFAP表达明显增多，着色密集，阳性的星形胶质细胞突起增粗且分支增多、变长、深染。四逆散低剂量组、四逆散高剂量组、氟西汀组海马DG区星形胶质细胞增生程度均较模型组明显改善。　　（九）1.海马NF-κ B p65相对蛋白量各组海马NF-κ B p65相对蛋白量比较无显著差异（P＞0.05）。　　2.海马DG区NF-κ B p65免疫组化结果镜下可见NF-κ B p65在各组大鼠海马DG区均有表达，呈棕黄色着色。雌雄空白组细胞浆都可见NF-κ Bp65阳性表达，但未见核内NF-κ Bp65阳性表达。雌雄模型组同样有胞浆NF-κ Bp65阳性表达，而且NF-κ Bp65在一部分细胞核内也有阳性表达，可见NF-κ Bp65发生核移位。与模型组比较，四逆散低剂量组、四逆散高剂量组和氟西汀组NF-κ Bp65同样主要是在浆表达，NF-κ Bp65核表达阳性细胞数较模型组减少，提示能抑制NF-κ Bp65蛋白核移位。　　（十）海马Phospho-NF-κ B p65相对蛋白量雄鼠各组海马Phospho-NF-κ B p65相对蛋白量比较无显著差异（P＞0.05）。雌鼠模型组较空白组海马Phospho-NF-κ B p65相对蛋白量显著升高（P＜0.05），四逆散低剂量组、四逆散高剂量组、氟西汀组均较模型组海马Phospho-NF-κ B p65相对蛋白量显著降低（P＜0.05）。　　结论:　　（一）单纯青少期慢性应激未引起动物抑郁障碍的特征性表现，但可出现一定的自主行为异常，并使雌鼠产生神经损伤，形成“生物瘢痕”，留下潜在的长期的影响。　　（二）单纯青少期慢性应激对中枢免疫的影响比外周免疫显著。　　（三）单纯青少期慢性应激可引起中枢免疫功能紊乱，包括免疫激活和免疫抑制同时发生，如小胶质细胞、星形胶质细胞状态改变，细胞因子升高或下降，NF-κ B通路激活等，具体表现具有性别差异。应激引起的神经“生物瘢痕”形成机制与中枢免疫功能紊乱相关。　　（四）四逆散可同时调节单纯青少期慢性应激引起的免疫激活和免疫抑制，改善免疫紊乱，恢复免疫平衡，改善神经元损伤，提示中药合剂对机体免疫的双向调节作用。本研究结果可为四逆散抗应激损伤早期临床应用提供实验依据。　　创新点:　　（一）既往研究慢性心理应激影响的动物实验大多针对成年阶段和雄性动物。本研究选取青少期阶段为研究对象，对雌雄动物进行研究，发现青少期慢性应激引起的潜在生物学改变及其性别差异，为精神障碍发病的预防和及早干预提供了实验基础。　　（二）既往为数不多的青少期应激研究主要从神经发生或神经内分泌的角度探讨其中枢病理改变。本研究结合当下研究热点之一的抑郁炎症假说，从免疫机制的角度，探讨青少期应激导致的免疫紊乱，尤其是中枢的免疫失衡，丰富了青少期应激的研究维度。　　（三）本研究结果反映出四逆散对青少期慢性应激引起的免疫紊乱能同时发挥相应的双向调节作用，为四逆散抗应激损伤早期临床应用提供了实验依据。

目录

声明

摘要

引言

第一章 应激免疫改变及青少期应激的研究进展

第一节 应激、免疫炎症与抑郁症

第二节 青少期应激的相关研究

第三节 应激免疫改变及青少期应激的中医药研究

第四节 展望

第二章 实验研究

第一节 四逆散对青少期慢性应激大鼠行为学的影响

一、材料

二、方法

三、结果

第二节 四逆散对青少期慢性应激大鼠海马神经元、星形胶质细胞和NF-κB的形态学影响

一、材料

二、方法

三、结果

第三节 四逆散对青少期慢性应激大鼠外周免疫炎症的影响

一、材料

二、方法

三、结果

第四节 四逆散对青少期慢性应激大鼠海马免疫炎症的影响

一、材料

二、方法

三、结果

第三章 讨论

第一节 四逆散对青少期慢性应激大鼠行为学的影响

第二节 四逆散对青少期慢性应激大鼠外周免疫炎症的影响

第三节 四逆散对青少期慢性应激大鼠中枢免疫炎症的影响

第四节 四逆散对青少期慢性应激免疫紊乱的双向调节作用

第五节 小结

结语

参考文献

附录

在校期间发表论文情况

致谢

附件