抗甘胆酸的重组单链抗体制备与免疫分析方法研究

摘要

甘胆酸(glycocholic acid，GCA)，属于二级胆酸，是类固醇酸的衍生物，由胆酸和甘氨酸在肝脏中结合生成的结合型胆酸，是胆汁酸的主要成分之一。GCA具有促进脂类乳化，加速脂类物质的消化和吸收的作用。GCA在血液和尿液中的浓度高低与肝细胞损害及胆汁酸代谢障碍的严重程度相关。因此，建立GCA的检测方法对其进行有效监测可以为各类肝脏疾病的鉴别、诊断、治疗和预后分析提供重要的依据。　　目前，GCA的检测方法主要包括高效液相色谱法、液质联用法、免疫学分析法等等。免疫分析法基于抗体和抗原之间特异性结合，具有灵敏度高、特异性强、简单、快速和便宜等优点，特别适用于大批量样本的筛查。抗体是影响免疫分析方法特异性和灵敏性的重要因素之一。传统的抗体包括多克隆抗体(polyclonal antibodies，pAb)和单克隆抗体(monoclonal antibodies，mAb);然而，这两种抗体存在着某些缺点，例如在多克隆抗体制备中批次与批次之间的差异;在单克隆抗体制备中耗时、生产成本高和步骤复杂等等。通过噬菌体展示技术，可以从抗体文库中淘选到具有高亲和力的重组抗体，并可通过测序获得抗体的编码序列。单链抗体(single-chian variable fragment，scFv)是最常见的重组抗体之一，是能够保持与抗原有效结合的最小单位，由轻链和重链可变区通过一段编码连接肽基因拼接后表达的重组蛋白。ScFv抗体具有易于原核表达和基因工程改造等优点，目前已广泛应用于医疗诊断、疾病治疗、环境监测和食品安全分析等领域。本研究以GCA为靶标，通过噬菌体展示技术筛选到了高亲和力的scFv抗体，主要研究结果如下:　　1噬菌体展示单链抗体文库的构建和淘选　　11通过完全抗原GCA-BSA对母鸡进行免疫，构建了库容量为3.34×107cfu的噬菌体scFv抗体文库。利用GCA标准品竞争洗脱的方式，进行了四轮条件苛刻的淘选后，通过phage-ELISA的方法对淘选后的抗体文库进行鉴定，对筛选到的阳性克隆子进行DNA测序分析，共获得4种具有高亲和力scFv的序列。　　2抗GCA特异性单链抗体的原核表达及应用　　21将灵敏度最高的噬菌粒scFv-G11进行原核表达和纯化，建立了基于scFv抗体检测尿液中GCA的间接竞争ELISA，灵敏度(IC50)为0.06μg/mL，线性范围(IC20～IC80)为0.02～0.18μg/mL，最低检测限(limit of detection，LOD)为0.01μg/mL，与TCA的交叉反应率为40％，与其它结构类似的胆酸的交叉反应率均低于058％。在尿液中的添加回收率为86～123％，并将检测结果与LC-MS/MS进行比对，结果显示两者具有良好的相关性(R2=0.99)。　　3生物素化单链抗体的制备及应用　　31分别通过化学法和酶催化法，将生物素标记scFv抗体。结果显示，酶催化生物素法标记scFv抗体所建立的ELISA具有更高的灵敏性。利用酶催化法标记的scFv抗体建立了间接竞争BA-ELISA，IC50值为0.42μg/mL，线性范围(IC20～IC80)为0.14～1.24μg/mL，检测限LOD为0.07μg/mL，与TCA的交叉反应率为43.75％，与其它结构类似的胆酸的交叉反应率均低于1.88％。在尿液中的添加回收率为110.8～125.6％，检测结果与LC-MS/MS进行比对，结果显示两者相关性良好（R2=099）。　　综上所述，本研究利用噬菌体展示技术筛选到了4个高灵敏度的scFv抗体。此外，将具有较高灵敏度的scFv抗体，通过酶催化法，将生物素标记到scFv抗体。通过scFv抗体和生物素化的scFv抗体，分别建立了ELISA和BA-ELISA检测方法。本研究建立的免疫学分析方法可以对GCA进行有效的检测，对肝功能的监控具有重要的意义。

目录

摘要

第一章 前言

1．1．2 甘胆酸的结构及其理化性质

1．1．3 甘胆酸的简介

1．1．4 甘胆酸的检测对疾病诊断的意义

1．1．5 甘胆酸检测方法的研究进展

1．2 小分子化合物特异性抗体的研究概述

1．2．1 多克隆抗体

1．2．2 单克隆抗体

1．2．3 基因工程抗体

1．3 主要研究内容和意义

1．3．2 研究意义

1．3．3 技术路线

第二章 甘胆酸特异单链抗体的筛选

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．2 主要试剂

2．2．3 菌株和载体

2．2．4 实验动物

2．2．5 引物

2．2．6 主要缓冲液及培养基

2．3 实验方法

2．3．2 甘胆酸免疫原和包被原的合成

2．3．3 动物免疫

2．3．4 单链抗体基因的扩增

2．3．5 载体pComb3X和单链抗体基因片段的酶切反应

2．3．6 载体pComb3X和单链基因片段的连接

2．3．7 载体pComb3X和单链基因片段连接产物的电转化

2．3．8 单链抗体噬菌体展示文库的构建

2．3．9 单链抗体噬菌体展示文库的淘选

2．3．10淘选结果的评估

2．3．11特异性单链抗体阳性克隆的筛选

2．3．12噬菌粒的提取

2．3．13噬菌粒的测序

2．4 实验结果

2．4．1 抗体轻链可变区和重链可变区及单链抗体基因的扩增

2．4．2 单链抗体噬菌体文库的构建及鉴定

2．4．3 单链抗体噬菌体文库的亲和淘选

2．4．4 特异性噬菌体单克隆的鉴定

2．4．5 单链抗体的氨基酸序列分析

2．5 讨论

2．6 本章小结

第三章 甘胆酸特异单链抗体的原核表达及应用研究

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 仪器及耗材

3．2．2 主要试剂

3．2．3 载体和菌株

3．3．2 质粒pComb3x-scFv的化学转化

3．3．4 单链抗体蛋白的原核表达

3．3．5 单链抗体蛋白的纯化

3．3．8 建立基于单链抗体检测尿液中GCA的ELISA

3．4 实验结果

3．4．1 单链抗体蛋白的诱导表达、纯化及鉴定

3．4．2 基于单链抗体蛋白ELISA检测条件的优化

3．4．3 加标回收率

3．5 讨论

3．6 本章小结

第四章 基于生物素化单链抗体的应用研究

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 主要仪器

4．2．2 主要试剂

4．2．3 主要耗材

4．2．4 载体和菌株

4．2．5 引物

4．2．6 主要缓冲液及培养基

4．3 实验方法

4．3．1 化学生物素法标记单链抗体

4．3．2 酶催化生物素法标记单链抗体

4．3．3 建立基于生物素化单链抗体检测尿液中GOA的BA-ELISA

4．4 实验结果

4．4．1 基于化学生物素法标记单链抗体的BA-ELISA

4．4．2 生物素化融合蛋白表达载体pINQ-BtH6-G11的构建

4．4．3 建立基于生物素化单链抗体蛋白检测尿液中GCA的BA-ELISA

4．5 讨论

4．6 本章小结

第五章 结论与展望

5．1 结论

5．1．3 基于生物素化单链抗体的应用研究

5．2 展望

参考文献

攻读博士学位期间发表的论文

声明

致谢