利用日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3检测血吸虫抗原及抗体的研究

摘要

目的:制备日本血吸虫(中国大陆株)重组信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3),并制备抗rSj14-3-3蛋白的单克隆抗体和多克隆抗体,探讨纯化的rSj14-3-3蛋白及其相应的单克隆抗体和多克隆抗体对日本血吸虫病的诊断价值。
　　方法:通过对含有重组质粒pET28a-Sj14-3-3的工程菌E.coli BL21的诱导培养,制备rSj14-3-3蛋白,以蛋白纯化试剂盒(His-Bind Purification Kit)予以纯化,获得高纯度的rSj14-3-3蛋白,以纯化后的rSj14-3-3蛋白为抗原免疫Balb/c小鼠,用杂交瘤技术制备抗rSj14-3-3蛋白的单克隆抗体并予以纯化。通过间接ELISA方法测定单克隆抗体的效价,并用Western blotting鉴定单克隆抗体的特异性。同时,以纯化后的rSj14-3-3蛋白为抗原免疫家兔,制备抗rSj14-3-3蛋白的抗血清并予以纯化,制备相应的多克隆抗体,用间接ELISA法测定多克隆抗体的效价。以纯化的rSj14-3-3抗原用间接ELISA法分别对30例急性血吸虫病患者、30例慢性血吸虫病患者和50例健康人血清中的特异性抗体进行检测;用纯化的抗rSj14-3-3多克隆抗体为捕捉系统,以辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体HRP-1D4为检测系统的酶联免疫吸附试验检测上述急、慢性血吸虫病患者和健康人血清中的循环抗原。
　　结果:获得了高纯度的rSj14-3-3蛋白抗原;筛选出了能够稳定分泌抗rSj14-3-3单克隆抗体的杂交瘤细胞株1D4,其单克隆抗体的亚型经鉴定为IgG1,抗体的效价在107以上。通过间接ELISA法分别对30例急性血吸虫病患者和30例慢性血吸虫病患者血清中的特异性抗体进行检测,阳性率分别为100％(30/30)和96.7％(29/30);双抗夹心ELISA法分别对上述急、慢性血吸虫病患者血清中的循环抗原进行检测,阳性率分别为73.3％(22/30)和53.3％(16/30),这两种方法对50例健康人血清进行检测的阳性率均为0(0/50)。
　　结论:利用rSj14-3-3抗原间接ELISA法对急、慢性血吸虫病患者血清中的特异性抗体进行检测,具有高度的特异性和敏感性。利用基因工程技术可以规模化的生产rSj14-3-3抗原,且易于抗原的标准化,体现出广泛应用于血吸虫病免疫诊断和流行病学现场调查的巨大潜能;双抗夹心ELISA法对循环抗原的检测敏感性欠佳,但对急性血吸虫病患者仍有一定的诊断价值。该检测方法对血吸虫病患者体内循环抗原的检测有待进一步研究。

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缩略词表

1前言

1.1血吸虫病简介

1.2血吸虫病免疫诊断的研究进展

1.3 14-3-3蛋白介绍及重组14-3-3蛋白在血吸虫病诊断中的应用

1.4本课题的主要内容及研究意义

2实验材料与方法

2.1实验材料

2.2实验方法

3实验结果

3.1 rSj14-3-3蛋白的表达和纯化结果

3.2 rSj14-3-3蛋白浓度测定

3.3细胞融合的融合率、阳性率

3.4单抗亚型鉴定

3.5小鼠腹水及纯化后腹水的电泳比较

3.6单克隆抗体浓度测定

3.7间接ELISA测单抗1D4效价

3.8单克隆抗体1D4的Western bloting鉴定

3.9家兔血清效价测定

3.10酶标单抗1D4工作浓度的测定

3.11血清检测结果

4讨论

5结论

参考文献

致谢

硕士期间发表的论文