日本血吸虫信号蛋白14-3-3在毕赤酵母菌中的分泌表达及其抗原性分析

摘要

目的在毕赤酵母菌(Pichia pastoris)表达系统中表达日本血吸虫信号蛋白14-3-3(Sj14-3-3),并与原核表达rSj14-3-3比较其抗原性。方法以重组质粒pET28a-rSj14-3-3为模板,PCR扩增Sj14-3-3基因,将特异片段连接到pMD18-T载体,DNA序列分析后,亚克隆目的片段Sj14-3-3至酵母菌分泌表达载体pPICZαB。测序正确后,重组质粒经电转化转染至毕赤酵母菌X-33菌株,经抗生素Zeocin筛选得到高拷贝转化子。经甲醇诱导表达,取诱导上清进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹法(Western blotting)分析。用间接ELISA法比较毕赤酵母菌表达的rSj14-3-3和原核表达rSj14-3-3检测血吸虫病患者血清抗体的特异性和敏感性。结果目的基因已在酵母菌基因组中得到整合,PCR扩增得到约1 300 bp的片段。经甲醇诱导,Sj14-3-3表达并分泌到培养上清中。表达产物经SDS-PAGE测定为Mr 35 000。Western blotting结果显示,Mr 35 000蛋白可被Sj14-3-3单克隆抗体识别,表明该真核表达产物具有免疫反应性。间接ELISA检测结果表明,该重组蛋白检测36份急性血吸虫病患者血清rSj14-3-3抗体,阳性率为81%。与12份华支睪吸虫感染者血清未见交叉反应,32份健康人血清假阳性反应率为9.3%。以原核表达的rSj14-3-3为抗原,间接ELISA检测,36份急性血吸虫病患者血清的rSj14-3-3,抗体阳性率为88.9%;与12份华支睪吸虫感染者的交叉反应率为16.7%,32份健康人血清假阳性反应率为12.5%,其差异均无统计学意义(P>0.05)。结论在毕赤酵母菌中成功表达了Sj14-3-3,培养上清中产物丰度较高,且免疫反应性良好。