芹菜素对丙烯腈致大鼠精子质量及睾丸ASK1-JNK/p38信号通路影响的干预作用

摘要

目的：　　探讨芹菜素（apigenin，AP）是否对丙烯腈（acrylonitrile，ACN）所致大鼠精子质量及睾丸损伤有干预作用及其可能机制，为 ACN 的生殖毒性防护和AP的利用提供一定依据。　　方法：　　选用成年雄性SD大鼠60只，随机分为对照组（玉米油）、ACN组（46 mg/kg ACN）、低AP干预组（46 mg/kg ACN+117 mg/kg AP）、中AP干预组（46 mg/kg ACN+234 mg/kgAP）和高AP干预组（46 mg/kg ACN+351 mg/kg AP），每组12只，进行灌胃染毒，1次/d，6 d/w，28 d后处死大鼠：（1）摘取双侧睾丸和附睾，称重并计算脏器系数；（2）采用计算机辅助精子分析（computer-aided sperm analysis，CASA）系统分析精子密度、活率、活力和精子运动参数；制备精子伊红染色涂片，观察精子形态；制备精子吖啶橙染色涂片，观察精子 DNA 完整性；（3）制备睾丸组织病理切片，评估睾丸组织结构变化；（4）试剂盒检测睾丸组织中碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、酸性磷酸酶（acid phosphatase，ACP）、琥珀酸脱氢酶（succinate dehydrogenase， SDH）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）的活力；（5）试剂盒测定睾丸组织中丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量，超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、过氧化氢酶（catalase，CAT）活力及总抗氧化能力（total antioxidation capability，T-AOC）；（6）采用qRT-PCR技术测定睾丸组织中ASK1、MKK7、JNK、p38、Cyt c、Caspase-9、Caspase-3、Bax和Bcl-2mRNA相对表达水平；（7）采用Western Blot技术测定睾丸组织中ASK1、p-ASK1、MKK7、p-MKK7、JNK、p-JNK、p38、p-p38、Cyt c、Caspase-9、Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达水平；（8）制备TUNEL染色切片，检测睾丸组织的细胞凋亡水平。　　结果：　　（1）体重和脏器系数：与对照组比较，ACN组附睾湿重和附睾脏器系数显著降低（P＜0.05）；与ACN组比较，低AP干预组大鼠附睾湿重和附睾脏器系数显著升高（P＜0.05）。（2）精子质量：与对照组比较，ACN 组大鼠 a级和b级精子所占比例显著升高，d级精子所占比例显著降低（P＜0.05）；精子活率和精子活力显著升高（P＜0.05）；曲线速度（curve line velocity，VCL）、直线速度（straight line velocity，VSL）、平均路径速度（average path velocity，VAP）和平均移动角度（mean angular displacement，MAD）显著升高，鞭打频率（beat-cross frequency，BCF）显著降低（P＜0.05）。与对照组比较，ACN组大鼠精子畸形率、头部畸形率和尾部畸形率显著升高（P＜0.05）；与ACN组比较，低、中AP干预组大鼠精子畸形率和头部畸形率显著降低（P＜0.05）。与对照组比较，ACN组大鼠精子 DFI指数显著升高（P＜0.05）；与ACN 组比较，低、中AP干预组大鼠精子DFI指数显著降低（P＜0.05）。（3）睾丸组织结构：ACN组大鼠生精小管萎缩变形，管径变小、间质增宽，生精细胞层数减少、排列紊乱，管腔中成熟精子数目很少，低、中 AP 干预组生精小管较为完整，排列规则，管腔内可见各级生精细胞和成熟精子。（4）睾丸标志酶：与对照组比较， ACN组大鼠睾丸组织中AKP和SDH活力显著降低（P＜0.05）；与ACN组比较，低、中、高AP干预组大鼠睾丸组织中LDH活力显著降低，AKP活力显著升高（P＜0.05）。（5）睾丸组织氧化应激相关指标：与对照组比较，ACN 组大鼠睾丸组织中GSH-Px活力和T-AOC水平显著降低（P＜0.05）；与ACN组比较，低AP干预组大鼠睾丸组织中GSH含量和T-AOC水平显著升高（P＜0.05）；高AP干预组大鼠睾丸组织中GSH-Px活力显著降低（P＜0.05）。（6）基因检测结果：与对照组比较，ACN组大鼠睾丸组织中ASK1、MKK7、JNK、p38、Caspase-9和Bax mRNA相对表达水平升高，Bcl-2 mRNA相对表达水平降低（P＜0.05）；与ACN组比较，低AP干预组大鼠睾丸组织中MKK7、JNK、p38和Bax mRNA相对表达水平降低，Bcl-2 mRNA相对表达水平升高（P＜0.05）；中AP干预组大鼠睾丸组织中JNK和Bax mRNA相对表达水平降低，Bcl-2 mRNA相对表达水平升高（P＜0.05）；高 AP 干预组 Bax mRNA 相对表达水平降低（P＜0.05）。（7）蛋白检测结果：与对照组比较，ACN组大鼠睾丸组织中ASK1、p-ASK1、MKK7、p-MKK7、JNK、p-JNK、p38、p-p38、Cyt c、Caspase-9、Caspase-3和Bax蛋白表达水平升高，Bcl-2蛋白表达水平降低（P＜0.05），p-JNK/JNK、p-p38/p38 比值升高，Bcl-2/Bax 比值降低（P＜0.05）；与 ACN 组比较，低 AP干预组大鼠睾丸组织中ASK1、p-ASK1、MKK7、p-MKK7、JNK、p-JNK、p38、p-p38、Caspase-9、Caspase-3和Bax蛋白表达水平降低，Bcl-2蛋白表达水平升高（P＜0.05），p-JNK/JNK、p-p38/p38比值降低，Bcl-2/Bax比值升高（P＜0.05）；中AP干预组大鼠睾丸组织中ASK1、p-ASK1、MKK7、p-MKK7、JNK、p-JNK、p38、p-p38、Bax、Caspase-9和Caspase-3蛋白表达水平降低，Bcl-2蛋白表达水平升高（P＜0.05），p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK比值降低，Bcl-2/Bax比值升高（P＜0.05）；高AP干预组大鼠睾丸组织中Caspase-9、Caspase-3和Bax蛋白表达水平降低，Bcl-2蛋白表达水平升高（P＜0.05），p-ASK1/ASK1、p-JNK/JNK比值降低，Bcl-2/Bax比值升高（P＜0.05）。（8）TUNEL染色切片：与对照组比较，ACN组大鼠每生精小管中TUNEL阳性细胞数增加（P＜0.05）；与ACN组比较，低、中、高AP干预组大鼠每生精小管中TUNEL阳性细胞数减少（P＜0.05）。　　结论：　　（1）AP对ACN诱导的精子畸形和DNA损伤有保护作用，且可以减轻ACN诱导的大鼠睾丸组织病理损伤，改善睾丸标志酶的变化。　　（2）AP 可以通过减轻 ACN 诱导的睾丸氧化应激，抑制 ASK1-JNK/p38信号通路的激活和线粒体介导的细胞凋亡而发挥其保护作用。

目录

声明

第一章 前言

1.1 ACN概述

1.2 ACN的生殖毒性

1.3 ACN致生殖损伤的机制

1.4 AP概述

1.5 AP的生物学作用

1.6 研究目的和意义

第二章 材料与方法

2.1 实验动物

2.2 实验仪器与试剂

2.3 实验方案及技术路线

2.4 实验方法

2.4.1 动物分组及给药

2.4.2 体重及脏器系数的测定

2.4.3 精子相关实验

2.4.4 睾丸组织病理切片制备

2.4.5 睾丸组织标志酶测定

2.4.6 氧化应激相关指标测定

2.4.7 实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测相关基因表达水平

2.4.8蛋白免疫印迹（Western Blot）检测相关蛋白表达水平

2.4.9 TUNEL法检测大鼠睾丸细胞凋亡

2.2.10 统计分析

第三章 结果

3.1 大鼠一般情况和脏器系数变化

3.2 AP对ACN致大鼠精子损伤的干预作用

3.2.1 大鼠精子密度的变化

3.2.2 大鼠精子活动度的变化

3.2.3 大鼠精子运动参数的变化

3.2.4 大鼠精子形态的变化

3.2.5 大鼠精子DNA完整性的变化

3.3 AP对ACN致大鼠睾丸损伤的干预作用

3.3.1 大鼠睾丸组织形态的变化

3.3.2 大鼠睾丸标志酶的变化

3.4 AP对ACN致大鼠睾丸损伤干预作用的机制

3.4.1 大鼠睾丸组织氧化应激相关指标的变化

3.4.2 ASK1-JNK/p38信号通路

3.4.3 大鼠睾丸组织细胞凋亡

第四章 讨论

4.1 大鼠一般情况

4.2 AP对ACN致大鼠精子质量损伤的干预作用

4.2.1 大鼠精子密度和活动度的变化

4.2.2 大鼠精子运动参数的变化

4.2.3 大鼠精子形态的变化

4.2.4 大鼠精子DNA完整性的变化

4.3 AP对ACN致大鼠睾丸损伤的干预作用

4.3.1 大鼠睾丸组织形态的变化

4.3.2 大鼠睾丸标志酶的变化

4.4 AP对ACN致大鼠睾丸损伤干预作用的机制

4.4.1 睾丸组织氧化应激相关指标的变化

4.4.2 ASK1-JNK/p38信号通路相关基因和蛋白的变化

4.4.3 睾丸细胞凋亡相关指标的变化

第五章 结论

5.1 结论

5.2 研究不足与展望

参考文献

附录

在学期间研究成果

致谢