过表达bldD基因对红色糖多孢菌红霉素产量及孢子形成的影响

摘要

红霉素（erythromycin）是一类具有广谱抗菌效果的大环内酯类抗生素，由革兰氏阳性菌红色糖多孢菌（Saccharopolyspora erythraea，也称糖多孢红霉菌）产生。红霉素在临床上应用非常广泛，所以提高红霉素产量具有重要意义。红色糖多孢菌中红霉素产量受多种因子影响，已发现多个基因可影响红霉素的生物合成，2008年在红霉素高产菌株中发现bldD基因是红霉素合成的正调控基因。正调控基因在目的链霉菌中过量表达可获得抗生素高产菌株，此种方法已发展的较为成熟。所以在本研究中我们进一步在红色糖多孢菌A226中过表达bldD基因，以期获得红霉素高产菌株，并探讨过表达bldD基因对红色糖多孢菌形态分化过程的影响。
　　 本实验首先通过基因工程方法成功构建了可在红色糖多孢菌中表达的整合型质粒pZMW-bldD质粒。为了检测该质粒在红色糖多孢菌中的活性，将其在PEG介导下转入红色糖多孢菌突变株A226-△bldD中，该突变株是由本实验室构建的红色糖多孢菌bldD基因突变菌株，其产红霉素水平明显降低且丧失产孢能力。通过安普抗性筛选及PCR鉴定获得一株pZMW-bldD质粒在突变株A226-△bldD中转化成功的阳性菌株，即红色糖多孢菌A226-△bldD/bldD。同时接种A226-△bldD/bldD、A226-△bldD及对照菌株A226到TSB液体培养基中发酵120h，运用高效液相色谱分析各菌株发酵液中红霉素含量，发现菌株A226-△bldD/bldD产红霉素水平可提高到接近正常菌株的产红霉素水平。同时将上述菌株接种到R3M固体培养基上，30℃恒温培养，比较这几株菌株的孢子形成情况，发现在回补菌株A226-△bldD/bldD中孢子形成能力得到恢复。这表明pZMW-bldD质粒可在红色糖多孢菌体内成功表达，这为下一步的研究奠定了基础。
　　 与上述方法类似本实验进一步在正常菌株A226中引入质粒pZMW-bldD，鉴定并获得bldD基因过量表达菌株A226/bldD。将菌株A226及A226/bldD同时接种到液体TSB培养基和固体R3M培养基上，比较这两个菌株的产红霉素水平及产孢情况的差异，发现菌株A226/bldD与A226产红霉素水平相比可提高20％，同时菌株A226/bldD较之A226产白色孢子的时间提前1-2天。
　　 本实验通过增加红色糖多孢菌调控基因bldD的拷贝数，成功构建了红霉素高产菌株A226/bldD，将该高产菌株运用于实际生产可有助于提高红霉素产量。同时在本实验中也发现bldD的拷贝数对红色糖多孢菌产孢时间也有影响，含有高拷贝bldD基因的菌株产孢时间可提前，这为进一步研究红色糖多孢菌的形态分化奠定了基础。

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1 引言

2材料与方法

3 结果与分析

4 总结

参考文献

附录

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