利用eryK基因和eryG基因提高红霉素产量及糖多孢红霉菌SACE_0012基因功能的研究

摘要

放线茵次级代谢可产生多种生物活性物质，这些物质根据功能可分为抗生素、免疫抑制剂、抗病毒药物、抗肿瘤药物等，糖多孢红霉菌(Saccharopolyspora erythraea)次级代谢产生红霉素A(ErA)能有效抗呼吸道感染，是一类抗革兰氏阳性菌的广谱抗生素，因此提高红霉素A产量的研究具有重要的经济价值。次级代谢物的产生受到多种理化因素的影响，如前体供应、溶氧浓度、环境温度和酸碱度等。传统提高次级代谢物方法是通过随机诱变筛选高产菌株，随着分子生物学技术的日渐成熟，利用代谢工程方法对生物合成途径进行遗传修饰，实现次级代谢物产量的提高。
　　 本研究通过增加红霉素生物合成基因eryK和eryG基因拷贝数，提高红霉素C12羟化酶(EryK)和红霉素3

目录

声明

摘要

缩略词表

第1章 前言

1．1 代谢工程在放线菌中的研究

1．2 改变结构基因和调控基因对放线菌抗生素产量的影响

1．2．1 改变参与代谢产物生物合成酶的结构基因

1．2．2 改变生物合成途径的调控基因

1．3 放线菌形态分化

1．4 研究内容

1．4．1 整合表达载体pZMWKKG的构建

1．4．2 工程菌ZMD／pZMW和ZMD／pZMWKKG菌株的构建和筛选

1．4．3 糖多孢红霉菌TetR家族SACE_0012基因删除对形态分化的影响

1．5 研究意义

第2章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 引物

2．1．2 质粒

2．1．3 菌种

2．1．4 培养基

2．1．5 DNA标记物、工具酶

2．1．6 缓冲液和有机混合液

2．1．7 试剂盒、试剂

2．1．8 仪器设备

2．2 实验方法

2．2．1 糖多孢红霉菌总基因组DNA的小量提取

2．2．2 糖多孢红霉菌总基因组DNA的大量提取

2．2．3 DNA片段的PCR扩增

2．2．4 DNA的琼脂糖凝胶电泳

2．2．5 DNA的纯化

2．2．6 大肠杆菌中质粒DNA的小量提取

2．2．7 片段DNA和质粒DNA的特异性酶切和连接反应

2．2．8 大肠杆菌感受态细胞的制备和转化

2．2．9 糖多孢红霉菌原生质体的制备、转化

2．2．10 糖多孢红霉菌孢子的保藏

2．2．11 红霉素发酵产物的萃取

2．2．12 红霉素发酵产物的抑菌活性检测

2．2．13 红霉素发酵产物的TLC分析

第3章 红霉素高产工业菌株的筛选

3．1 前言

3．2 结果与分析

3．2．1 糖多孢红霉菌整合表达质粒pZMWKKG的构建

3．2．2 整合表达载体pZMWKKG质粒的验证

3．2．3 红霉素高产菌株ZMD／pZMWKKG的构建和筛选

3．3 讨论

第4章 糖多孢红霉菌TetR家族SACE_0012基因的功能分析

4．1 前言

4．2 结果与分析

4．2．1 ΔSACE_0012突变体孢子生长情况

4．2．2 ΔSACE_0012／ΔSACE_7040突变体构建和孢子生长情况

4．2．3 ΔbldD／ΔSACE_0012突变体的孢子生长情况

4．3 讨论

第5章 总结

5．1 获得的主要结果

5．2 创新之处

5．3 下阶段研究内容

参考文献

致谢