微管蛋白、AQP4和Kir4.1在大鼠脊髓损伤后的时间变化与脊髓水肿相关性的研究

摘要

目的：通过制作大鼠急性脊髓损伤（ASCI），探究微管蛋白、水通道蛋白4（aquaporins-4）和K+通道4.1（inwardly-rectifyingpotassiumchannel,Kir4.1）在大鼠急性脊髓损伤后的时间变化规律及探寻这三者与急性脊髓损伤后脊髓水肿发展的关系，并探讨其机制。　　方法：90只成年雌性Sprague-Dawley大鼠，随机分组为假手术组(n=30)和损伤组（n=60），假手术组为空白对照组（30只），定位第10胸椎（T10）后暴露椎板，咬除T10椎板后逐层缝合。损伤组为ASCI组（60只），设6h、1d、3d、5d、7d五个时间点，每个亚组12只大鼠。用Allen打击法制备T10打击损伤模型，打击强度为20g×2.5。损伤后6h、1d、3d、5d、7d行脊髓含水量测量，术后6h、1d、3d、5d、7d时，各组各时间点分别取大鼠脊髓行HE染色，观察急性脊髓损伤后脊髓病理变化。损伤组各亚组各时间点取脊髓组织行微管蛋白、水通道蛋白4和钾离子通道4.1免疫组织化学染色和Western-blotting检测，观察急性脊髓损伤后三组蛋白的表达变化及相对灰度值分析。对损伤组各亚组各时间点三组蛋白表达变化和脊髓水肿含水量变化进行相关性分析。　　结果：术前各组脊髓含水量检测未见明显差异（P＞0.05），损伤各组各时间点脊髓含水量于伤后6h开始增加，并于第5d达到顶峰；HE染色显示：假手术组脊髓组织形态完整，髓内组织分布均匀，白质和灰质结构清晰完整，细胞排列有序，损伤后6h，主要以灰质和中央管出血为主，细胞间隙可见肿胀；伤后1d，脊髓灰质出血严重，结构紊乱，神经元肿胀；损伤后3d，灰质白质坏死面积增大，细胞肿胀明显，神经元发生核固缩，损伤后5d和7d，脊髓灰质白质出血减少，坏死严重，细胞水肿明显，有囊腔和空泡形成，神经元数量减少。免疫组化及半定量分析显示，AQP4在正常脊髓中表达量较低，主要分布于中央管和灰质，伤后6h表达略有下降，1d后升高，伤后3d显著升高，并于5d达到顶峰，7d时略有下降，而微管蛋白与钾离子通道4.1表达成相同趋势，假手术组中表达量高于各时间点亚组，即术后6h、1d表达量略有下降，3d下降明显且于伤后第5d最低，7d表达又有所上升。Western-blot检测显示AQP4、微管蛋白和kir4.1相对灰度值分析结果与免疫组化阳性细胞百分比分析结果基本一致，即脊髓损伤后随着之间推移AQP4表达逐渐增高，第5d最高后第7d下降，而微管和Kir4.1则与AQP4表达相反，即损伤后表达逐渐降低，且于第5d时达到峰值，第7d略有回升。损伤后AQP4表达与脊髓含水量呈正相关，而微管蛋白与Kir4.1与脊髓含水量呈负相关。　　结论：本实验首次明确了急性脊髓损伤后，AQP4、微管蛋白和Kir4.1在脊髓中的分布以及损伤后的表达变化规律，并且发现AQP4表达增高和微管蛋白、Kir4.1降低与损伤后脊髓含水量的变化呈相关性，可能导致脊髓水肿的形成。

目录

声明

第一章 前言

第二章 实验方法和实验材料

2.1 实验主要试剂、仪器和实验动物

2.1.1 各组动物分组

2.1.2 实验所需试剂和主要仪器

2.2 实验方法

2.2.1 SD大鼠脊髓损伤模型的制备

2.2.2 大鼠脊髓打击损伤活体取材

2.3 大鼠脊髓打击损伤灌注取材

2.4 脊髓石蜡切片的制作

2.5大鼠脊髓打击损伤后脊髓含水量的测定

2.6各组脊髓HE染色

2.7微管蛋白、AQP4、Kir4.1免疫组织化学染色检测

2.8脊髓组织总蛋白的提取

3.0统计学分析

第三章 结果

3.1 一般情况

3.2 脊髓含水量

3.3各组脊髓组织病理学观察

3.4免疫组织化学染色检测AQP4表达

3.5免疫组织化学染色检测α-Tubulin和Kir4.1表达

3.6微管蛋白、AQP4、Kir4.1免疫组化阳性面积百分比分析

3.7 Western blot检测α-Tubulin、AQP4和Kir4.1的含量

3.8α-Tubulin、AQP4和Kir4.1蛋白免疫印迹条带灰度值分析

3.9微管蛋白、水通道蛋白、钾离子通道与脊髓含水量相关性分析

第四章 结论

第五章 讨论

参考文献

在学期间研究成果

中英文索引

综述

致谢