具有成骨、成血管特性的三维微组织的异位成骨实验研究

摘要

目的：将兔骨髓间充质干细胞，成骨细胞以及人脐静脉内皮细胞共培养体外构建三维微组织，并植入裸鼠皮下观察其异位成骨的能力。方法：1.兔骨髓间充质干细胞（Bonemarrowderivedmesenchymalstemcells,BMSCs）的分离与培养：全骨髓贴壁法获得rBMSCs并培养纯化，贴壁细胞达到90%左右时传代，进行形态观察及生长记录。2.兔成骨细胞的诱导分化：取融合至80%-90%的P2代rBMSCs，更换为成骨诱导液进行诱导成骨，连续诱导14天后收获以进行后续实验并检测成骨特性。3.人脐静脉内皮细胞的复苏与培养：将液氮中冻存的人脐静脉内皮细胞取出，水浴复苏原代细胞，显微镜下观察形态及生长状况，传代培养后用于后续实验。4.三维微组织的体外构建：将三维微组织分为两组，一组为成骨细胞与间充质干细胞1：1混合（OB组），以5×104个/cm2的密度接种至96孔低黏附培养板中，隔天换液培养7天；一组为成骨细胞、间充质干细胞与人脐静脉内皮细胞1：1：1混合（共培养组），同样以5×104个/cm2的密度接种至96孔低黏附培养板中，隔天换液培养7天。5.两组三维微组织植入裸鼠皮下：将每96个微球注射植入一只裸鼠皮下位点，于植入后2周、4周通过大体观察、HE染色、茜素红染色、碱性磷酸酶染色及CD31免疫荧光染色等检测植入微球的成骨能力和成血管能力。结果：1.成功分离培养兔骨髓间充质干细胞，细胞呈长梭形，旋涡状生长。2.成功诱导兔骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞，成骨细胞呈多角形或立方形，表面有短突起，茜素红染色见橙红色钙结节。3.复苏人脐静脉内皮细胞：人脐静脉内皮细胞复苏后为P1代，贴壁生长，呈“铺路石状“排列。细胞扁平多角形。4.成功构建三维微组织：细胞在96孔低黏附培养板中培养1周，肉眼观察可见细胞聚集成球状，两组茜素红染色及碱性磷酸酶染色表明两组微球均有成骨能力，CD31免疫荧光显示共培养组有成血管潜力。5.植入2周，OB组与共培养组植入位点均发现组织结节，4周后，两组植入位点处组织结节变小，边界清晰，表面按压较硬。HE及茜素红染色发现共培养组较OB组成骨多，CD31染色发现共培养组形成血管数目远多于OB组。结论：1.使用低黏附培养板可以比较简单易操作地形成三维微组织，且其质地较为紧密。2.用骨髓间充质干细胞、成骨细胞及人脐静脉内皮细胞体外构建的三维微组织植入裸鼠体内后具有成骨成血管的能力。

目录

声明

中英文缩写词

前言

文献回顾

实验一 三种细胞的体外培养与诱导分化

1. 实验材料

1.1 实验动物

1.2 实验试剂

1.3实验仪器

2. 实验方法

2.1 兔骨髓间充质干细胞的体外分离及培养

2.2 成骨细胞的诱导分化

2.3 人脐静脉内皮细胞的复苏及培养

3. 实验结果

3.1兔骨髓间充质干细胞生长及形态观察

3.2兔成骨细胞诱导分化形态观察

3.3兔成骨细胞成骨能力检测

3.4人脐静脉内皮细胞培养形态观察

4. 实验讨论

实验二 三维微组织的体外构建

1. 实验材料

1.1实验动物

1.2实验试剂

2. 实验方法

2.1构建成骨细胞和干细胞共培养微球

2.2构建成骨细胞、干细胞及内皮细胞共培养微球

2.3对以上两组微球的组织学染色

3. 实验结果

3.1成骨细胞与干细胞共培养微球

3.2成骨细胞、干细胞与内皮细胞共培养微球

4. 实验讨论

实验三 三维微组织的异位成骨

1. 实验材料

1.1实验动物

1.2实验试剂

1.3实验仪器

2. 实验方法

2.1细胞的分离及培养

2.2细胞微球的制备

2.3微球的体内植入及取材

2.4植入物检测

3. 实验结果

3.1裸鼠的皮下注射

3.2 大体观察分析

3.3组织染色

3.4 CD31免疫荧光染色

4. 实验讨论

结论与展望

参考文献

病例报告 安氏Ⅲ类伴偏颌非手术治疗成人患者一例

在学期间研究成果

致谢