乳腺癌细胞β2-微球蛋白相互作用蛋白质筛选与验证的研究

摘要

乳腺癌是人类肿瘤中常见的类型，据统计，全世界每年大约有120万左右女性被诊断为乳腺癌，其中大约有50万患者死于乳腺癌。近年来乳腺癌发病呈增长趋势，严重威胁人类生命健康。在中国每年乳腺癌新发病例和死亡人数约占全世界的10％。乳腺癌在生长过程中所体现的病理组织形态、侵袭能力、分子分型、基因组、对治疗的反应及预后上的显著个体差异，说明乳腺癌是一类高度异质性的恶性肿瘤。目前被分为管腔上皮A型、管腔上皮B型、HER-2过表达型、基底样型四种分子分型。　　β2-微球蛋白（β2-M）是一种在所有有核细胞中合成且分子量为11.8 KDa，由100个氨基酸组成的非糖基化蛋白，在细胞表面通过非共价键作为主要组织相容性复合体(MHC) I类分子的轻链亚基。一般情况下，人体血液、尿液中游离状态的β2-M处于含量相对恒定的正常水平，但是癌症患者血清中β2-M的浓度一般偏高，并且它可以作为生长刺激因子和细胞信号分子调控多种癌细胞的生存、增殖、浸润、血管发生和转移。因此，β2-M及其相互作用蛋白质的研究将有助于了解β2-M参与乳腺癌调控的分子机制及发现新的治疗靶点。　　前期研究发现，β2-M 参与调控肿瘤多条信号通路，在不同分子分型乳腺癌中，β2-M 可能通过不同的分子机制或信号通路来参与肿瘤调控，但机制不清。因此，筛选β2-M互作蛋白有利于研究β2-M参与乳腺癌调控机理。本文首先从本实验室前期研制的7株β2-M抗体中筛选适合β2-M免疫印迹和免疫沉淀的抗体。然后利用免疫沉淀（IP）结合质谱分析（MS）技术，在乳腺癌细胞中，筛选与β2-微球蛋白相互作用的蛋白质。然后从质谱结果中经生物信息学分析选取具有高丰度、高可信度的互作蛋白，在三种分子分型乳腺癌细胞中进行初步验证。最后运用酵母双杂交，筛选阳性克隆，验证与 β2-M 相互作用的候选蛋白；构建真核表达重组质粒，转化 HEK-293T 细胞，通过免疫共沉淀实验，验证外源表达的β2-M 与侯选互作蛋白具有特异性的相互作用；His pull-down 实验验证β2-M与侯选互作蛋白的直接相互作用。　　实验结果显示：β2-M抗体4G3可用于β2-M的免疫印迹和免疫沉淀。质谱分析找到钙联蛋白（CALN）、蛋白质二硫键异构酶A3（ERP57）、血色素沉着蛋白（HFE）、钙网蛋白（CALR）等四种β2-M互作蛋白候选蛋白，经免疫共沉淀实验初步验证HFE为β2-M的互作蛋白，其余三种蛋白不是乳腺癌细胞中 β2-M的互作蛋白。酵母双杂交实验组能够激活下游报告基因，长蓝色菌斑。免疫共沉淀实验验证外源表达的β2-M与HFE相互作用。His pull-down实验验证了β2-M与HFE的直接相互作用。综上所述，β2-M互作蛋白的筛选与验证，为研究β2-M参与乳腺癌细胞分子调控机制提供了重要线索和依据，为进一步探索β2-M在癌症治疗中的靶点作用提供理论依据。

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Abstract

第一章 绪论

1.1 β2-微球蛋白结构和功能概述

1.2 乳腺癌概述

1.3 β2-微球蛋白参与乳腺癌调控的机制研究

1.4 蛋白质相互作用的研究方法

1.4.1 酵母双杂交

1.4.2 免疫共沉淀

1.4.3 融合蛋白沉降技术

1.4.4 质谱及生物信息学分析

1.5 研究内容与技术路线

第二章 实验材料及方法

2.1 实验材料

2.1.1 细胞株及质粒

2.1.2 主要试剂

2.1.3 主要抗体

2.2 主要仪器

2.3 主要溶液配制

2.4 细胞培养

2.5 总蛋白提取及蛋白浓度测定

2.5.1 总蛋白提取

2.5.2 BCA法测定蛋白浓度

2.6 免疫印迹

2.7 免疫共沉淀

2.8 质谱分析

2.9 酵母双杂交载体构建

2.9.1引物设计

2.9.2 反转录cDNA

2.9.3 扩增目的基因

2.9.4 切胶回收

2.9.5 目的基因和质粒的双酶切

2.9.6 连接目的基因和质粒

2.9.7连接产物转化

2.9.8 菌落PCR鉴定

2.9.9 保菌及测序

2.10 酵母双杂交

2.10.1 质粒小量提取

2.10.2 酵母感受态制备

2.10.3 质粒转化酵母感受态Y2H Gold

2.10.4 毒性和自激活检测

2.10.5 酵母双杂交及各轮验证

2.11 去内毒素质粒提取及瞬时转染

2.11.1 去内毒素提质粒

2.11.2 质粒转染293T细胞

2.12 His pull-down

2.12.1真核表达载体构建

2.12.2 融合蛋白的表达

2.12.3 诱导原核表达及蛋白复性

2.12.4 His pull-down

第三章 结果与讨论

3.1 抗体筛选

3.2 质谱检测与生物信息学分析

3.2.1筛选差异条带

3.2.2质谱检测与生物信息学分析

3.3 互作蛋白的初步验证

3.4 酵母双杂交验证β2-M与HFE相互作用

3.4.1诱饵载体和靶载体构建

3.4.2酵母双杂交结果

3.5免疫共沉淀验证β2-M与HFE相互作用

3.5.1 HFE真核表达载体构建

3.5.2免疫共沉淀验证

3.6 His pull-down验证β2-M与HFE相互作用

3.7讨论

第四章 结论

4.1 主要结论

4.2 研究展望

参考文献

致 谢