拟南芥Athspr突变体对热激胁迫的应答反应及相关基因的克隆与表达分析

摘要

我们利用T-DNA插入诱变技术获得了600多个拟南芥启动子诱捕系(promoter trap lines)，分离到一个多效突变体，其最显著的特征是生长发育迟缓，营养生长阶段延长，叶片等器官体积减小，植株矮化，抗逆性降低。对突变体相关基因的克隆和核苷酸序列比对分析发现，该基因为热激蛋白相关基因，命名为Athspr(heat shock protein-related in Arabidopsis thaliana)。本研究Athspr突变体为材料，研究了突变体和野生型对逆境信号的敏感性、对外源激素的响应和内源激素水平的差异，并运用分子生物学手段对Athspr基因在转录和翻译水平上的表达情况进行了分析，主要研究结果如下： 1、长期温和热胁迫(30℃)条件下Athspr突变体生殖生长受到严重抑制，到100天时仍然处于营养生长状态，丝毫没有抽薹的迹象，植株矮小短簇，叶片丛生；但是在短期极限温度胁迫条件下，突变体仍具有诱导的热耐受性，生长并未受到明显抑制。 2、Athspr突变体的生长发育特性与激素关系的研究结果显示，野生型和突变体对IAA具有基本一致的应答反应，但是高浓度的IAA抑制了突变体的萌发；而突变体对于TIBA的响应则没有野生型显著，种子的萌发未受到明显的抑制。由此推测突变体的内源生长素含量降低或者对生长素信号的响应通路有缺陷。通过HPCL法对突变体和野生型内源激素含量进行了检测，结果表明突变体的内源生长素含量仅为野生型的46.25％。 3、对突变体中T-DNA诱捕基因.Athspr基因的全长序列进行了克隆，分别得到了3233bp的基因组序列与3054bp的cDNA序列，测序结果表明以上序列分别是拟南芥Athspr基因全长序列以及CDS序列。 4、通过RT-PCR对正常生长条件以及热激胁迫条件下野生型和突变体中Athspr基因的表达水平进行了初步的检测，发现在正常生长条件下两者的表达水平基本一致；在38℃热激胁迫下，该基因在野生型和突变体中表达量相似；与正常条件下的表达水平无明显差异。 5、采用双向电泳技术对其在热激条件下的叶片全蛋白进行了分离，并分别从各个蛋白电泳图谱中分别鉴定出1000多个蛋白点。对热激前后蛋白表达谱的比较分析发现，2h和8h热激处理后野生型蛋白表达谱变化情况均大于突变体，表明野生型可能对热激胁迫的反应更为强烈，而突变体则比较弱。进一步选取在野生型和突变体中表达明显有差异的3个高丰度蛋白质点进行质谱鉴定，结果表明该蛋白组分分别为富含甘氨酸RNA结合蛋白7，细胞色素b6-f复合物铁硫亚单位及放氧增强蛋白1-2。以上3个蛋白均与植株在胁迫条件下的抗性有关。 以上结果表明，T-DNA插入确实引起了插入位点基因功能的改变，进而导致了突变体一系列形态、结构、发育以及热耐受性的改变。说明Athspr基因可能是调节拟南芥正常生长发育信号通路中极为重要的一员，同时对于拟南芥的热耐受能力的发挥也具有重要的作用。

目录

文摘

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论文说明：缩略词表

声明

第一章前言

1. T-DNA介导的基因诱捕技术及其在研究植物基因功能中的应用

2.植物激素的研究概况

2.1.植物激素在植株发育过程中的作用

2.2.生长素的生物合成及运输

2.3.生长素的测定分析方法

3.HSP101研究进展

3.1.HSP100/ClpB蛋白的生物学功能

3.2.HSP100/ClpB家族的蛋白结构特征

3.3.HSP100/ClpB蛋白的分子伴侣功能及其作用机制

4.蛋白双向电泳技术

4.1.蛋白质组学及其研究内容

4.2.双向聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-PAGE)

5.研究目的和意义

第二章胁迫条件下突变体与野生型的表型分析

1.材料及培养条件

1.1.实验材料

1.2.培养条件

2.方法

3.结果

3.1.长期温和热胁迫条件下突变体的表型观察

3.2.短期致死温度胁迫条件下突变体的表型观察

4.讨论

第三章突变体对外源激素的响应及其内源激素水平的分析

1.材料

2.方法

2.1.外源激素处理

2.2.HPLC法对突变体与野生型内源激素含量的测定

3.结果

3.1.突变体和野生型对外源激素响应的比较分析

3.2.突变体和野生型内源激素含量的比较与分析

4.讨论

第四章Athspr基因全长序列的克隆及分析

1材料

1.1.实验材料

1.2.酶及生化试剂

2.方法

2.1.CTAB法提取DNA

2.2.Trizol法提取RNA

2.3.PCR反应扩增Athspr全长序列

2.4.RT-PCR法检测Athspr的表达

3.结果

3.1.Athspr全长序列的克隆及分析

3.2.突变体和野生型中Athspr的表达分析

4.讨论

第五章热激条件下拟南芥突变体叶片蛋白的表达分析

1材料

2.方法

2.1.TCA-丙酮沉淀法制备蛋白样品

2.2.双向电泳(2-DE)

3.结果

3.1.拟南芥叶片蛋白质双向电泳图谱分析

3.2.突变体与野生型叶片蛋白质表达差异分析

3.3.差异蛋白点的获取

3.4.差异蛋白的质谱分析

4.讨论

结论与展望：

读研期间的研究成果

参考文献

图版

致谢