重组人p53转染淋巴瘤源性树突状细胞的抗肿瘤免疫效应

摘要

目的：树突状细胞(dendritic cell，DC)是目前已知唯一能激活初始T细胞(naive T cells)功能最强的抗原递呈细胞(antigen presenting cells，APC)，因其强大的抗原递呈功能和激活抗原后特异性的细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes CTL)反应，成为肿瘤生物免疫治疗的重要载体，而淋巴瘤源性DC(L-DC)既带有淋巴瘤瘤细胞抗原，同时又是抗原提呈细胞，来源于患者本人，不存在MHC限制性，能有效地激活特异的抗肿瘤免疫，在淋巴瘤的生物免疫治疗中发挥重要作用。但L-DC与正常人CD14+或CD34+前体细胞来源的CD83+的DC相比，其迁移、吞噬作用及抗原加工递呈功能减弱，使抗肿瘤免疫应答能力下降，同时由于肿瘤细胞释放细胞免疫抑制因子，引起DC的免疫耐受，这样就限制了DC在淋巴瘤免疫治疗中的作用，如何获得更具抗原递呈功能的DC，打破免疫耐受，成为目前研究的热点。有研究表明，p53基因突变和过度表达与NHL的发生发展有关[1]，在弥漫性大B细胞淋巴瘤中，其异常表达率可高达50％[2]。目前，体内和体外试验，应用重组人p53腺病毒(rAd-p53)，把wt-p53基因导入实体瘤中或与实体瘤细胞株共培养，可产生瘤细胞的生长抑制和诱导凋亡，同时增强了放疗的敏感性，从而使rAd-p53成为治疗实体瘤另外一种途径，为肿瘤的治疗提供了一种新的cc武器”[3-10]。并且发现腺病毒p53修饰DC后可使其表达内源性抗原，上调DC共刺激分子表达，产生特异性CTL效应。因此，如何获得临床上需要的有功能的L-DC及纠正瘤细胞内的突变的p53基因的功能，是急需解决的问题。目前，虽然分子靶向治疗药物的问世，如CD20单抗(美罗华)等，使得DLBCL的治愈率提高了很多，但在淋巴瘤的治疗中如何解决微小残留病灶(MRD)、DC免疫耐受等问题，仍然是目前临床治疗淋巴瘤遇到的难题，因此，我们利用rAd-p53能否诱导淋巴瘤瘤细胞为成熟DC，作为肿瘤疫苗治疗淋巴瘤及解决MRD、DC免疫耐受问题是本实验目的所在。 方法：采集经病理确诊的弥漫性大B细胞淋巴瘤的淋巴结和外周血的单个核细胞(MNC)进行培养。分为3组：实验组A(淋巴结源性DC转染rAd-p53，L-rAd-p53-DC)，实验组B(外周血源性DC转染rAd-p53，P-rAd-p53-DC)：对照组A(淋巴结源性DC转染tAd，L-rAd-DC)，对照组B(外周血源性DC转染rAd，P-rAd-DC)；空白对照组A(淋巴结源性DC未转染，L-N-DC)，空白对照组B(外周血源性DC未转染，P-N-DC)，以上各组均用GM-CSF+IL-4培养，至第7天，实验组加rAd-p53：对照组加rAd；空白对照组未加任何物质；各组于培养第8天加入TNF-a+CD40mAb继续培养48小时后，流式细胞仪检测DC免疫表型、酶联免疫吸附法(EUSA)进行上清夜IL-12水平测定，四甲基偶氮唑盐比色(MTT)法观察各组刺激T淋巴细胞增殖能力(MLR)及乳酸脱氢酶(LDH)法针对淋巴瘤瘤细胞的细胞毒作用(CTL效应)。在分离外周血过程中，贴壁的进行DC培养，非贴壁的培养成效应细胞。 结果：淋巴结源性和外周血源性的单个核细胞，经培养后均成功获得具有树突状突起的细胞，但以实验组树突状突起明显。结果显示：DC的表型(CD1a除外)CD83、CD80、CD86和HLA-DR实验组均较对照组及空白对照组明显增高(p<0.05)。上清液中IL-12分泌水平实验组均较对照组及空白对照组明显增高(p<0.05)。实验组具有明显的刺激自体淋巴细胞增殖的能力，且刺激能力随rAd-p53-DC与淋巴细胞比例的增加而升高。对照组也能刺激同种自体淋巴细胞增殖的能力，但较实验组组差(p<0.05)。对靶细胞的细胞毒作用(CTL效应)结果显示，实验组介导的细胞杀伤率显著高于对照组及空白对照组(P<0.05)。且实验组A的CTL效应明显高于实验组B，两者之间有显著性差异(P<0.05)。 结论：利用rAd-p53可以成功地诱导弥漫性大B细胞淋巴瘤瘤细胞和外周血来源单个核细胞为树突状细胞，形态学观察及细胞表型检测证实均为成熟DC，其IL-112分泌水平及介导的MLR和CTL效应明显强于非rAd-p53组所诱导的DC组。提示以rAd-p53-DC为基础的肿瘤疫苗有可能在解决淋巴瘤的MRD、DC免疫耐受等问题上发挥强大的治疗作用，为淋巴瘤的治疗研究提供了一个新的思路和策略。

目录

声明

前 言

材料和方法

结 果

讨 论

结 论

参考文献

硕士期间研究成果

致 谢

附录1 缩略词表

附录2 综 述 重组人p53腺病毒的应用前瞻