H<,2>O<,2>在绿豆不定根形成与发育中的信号作用及其机理

摘要

H<,2>O<,2>是植物细胞的可移动的信号分子，是植物细胞代谢的正常产物，各种生物和非生物胁迫能促使植物细胞产生过量H<,2>O<,2>，并通过H<,2>O<,2>信号转导响应环境胁迫。H<,2>O<,2>信号调控一系列重要的植物生理生化过程和基因表达，如系统获得抗性(SAR)和高度敏感抗性(HR)，细胞衰老与程序化死亡(PCD)，气孔关闭，根的向地性、根和侧根的生长，细胞壁的发育，柱头与花粉粒间的关系等。Ca<'2+>流动和可逆蛋白磷酸化作用是H<,2>O<,2>信号途径的下游信号，通过MAPK级联作用于转录因子，最终调控基因的表达。已经发现H<,2>O<,2>调控多种基因的表达，包括编码抗氧化酶基因和调控H<,2>O<,2>产生的蛋白，以及过氧物酶体生物发生所需要的蛋白。虽然近年来对H<,2>O<,2>信号及其功能的研究取得了一系列重要进展，但关于H<,2>O<,2>在植物不定根形成与发育过程中的信号作用的研究还未见文献报道。 不定根是指从茎、叶和老根的非中柱鞘组织产生的根，是植物无性繁殖的重要途径之一，普遍存在于被子植物和裸子植物界。各种外部环境的和内部的因子调控不定根的发生，已经发现的内部调控因子有矿质营养元素、糖、酚类、乙烯、多胺、NO、H<,2>O<,2>、CO、cGMP、MAPKs、植物激素和过氧化物酶等，其中生长素信号对不定根的形成起着关键作用，Ca<'2+>、乙烯、NO、H<,2>O<,2>、CO、cGMP、MAPK等可能都是生长素信号途径中的信使分子，参与了生长素诱导的不定根形成的信号途径，并最终调控生长素响应基因和不定根响应基因的表达。近年来，对生长素和不定根响应信号的研究受到广泛关注，并取得了许多重要成果，如发现NO是生长素诱导的不定根形成的信号分子，在不定根的诱导中IAA可能是通过NO而起作用的，cGMP和MAPK级联是NO信号途径的下游分子。那么，在不定根的诱导中，与NO性质相似的H<,2>O<,2>是否也具有与NO相同的信号作用，正是本文需要研究的问题。 本文基于当前的研究进展，运用形态学、生理学和生物化学的研究方法，以绿豆(Mucuna pruriens(Linn.)DClJar.utilis)为研究材料，研究了H<,2>O<,2>在不定根形成与发育中的作用、信号转导及其可能的生理生化机理。本文取得的主要结果与结论如下。 1．外源H<,2>O<,2>具有促进绿豆幼苗外植体不定根形成与生长的作用。用1-100 mMH<,2>O<,2>处理8-18 h能显著促进不定根的形成与生长，H<,2>O<,2>清除剂CAT和ASA能去除外源H<,2>O<,2>对不定根形成和生长的促进作用。CAT是H<,2>O<,2>的敏感的清除剂，外源CAT对不定根的形成和生长没有显著影响，但外源100 U CAT和H<,2>O<,2>一同处理时，外源H<,2>O<,2>对不定根的促进作用被CAT去除；H<,2>O<,2>是ASA最重要的降解底物，4 mM ASA与H<,2>O<,2>一同处理时，外源H<,2>O<,2>对不定根的促进作用被ASA去除。 2．H<,2>O<,2>是生长素诱导的绿豆幼苗外植体不定根形成过程中的信号分子。TIBA通过抑制IAA向茎基部的极性运输而强烈抑制不定根的形成，大于1 μM的TIBA强烈抑制绿豆幼苗外植体不定根的形成，而TIBA对不定根形成的抑制作用能被IAA部分地逆转，同时也能被H202部分地逆转，这说明IAA诱导绿豆不定根的形成可能是通过H<,2>O<,2>而起作用。 3．H<,2>O<,2>可能作为生长素的下游信号，参与生长素诱导的不定根形成的信号转导。DPI专一性抑制细胞内NADPH途径的H<,2>O<,2>的产生，发现10μM DPI处理48 h能强烈抑制绿豆不定根的形成，而H<,2>O<,2>和IBA能够部分地逆转DPI的抑制作用，这说明当NADPH氧化酶途径的内源H<,2>O<,2>的产生被抑制后，不定根的形成同时被抑制，证明H<,2>O<,2>可能参与了IBA诱导的不定根形成的信号过程。 4．H<,2>O<,2>可能只是生长素诱导的不定根形成过程中的下游信号之一。CAT与IBA一同处理时，CAT不能去除IBA对不定根的促进作用，是由于CAT是非细胞透过的，所以对内源H<,2>O<,2>没有清除作用：由于ASA是细胞透过的，外源ASA能够清除细胞内的H<,2>O<,2>，ASA能够去除外源H<,2>O<,2>诱导的不定根数量的增加，但对IBA诱导的不定根形成没有明显去除作用，这可能说明，H<,2>O<,2>只是生长素响应的不定根形成信号网络中的成员之一。 5．IBA处理能够显著促进绿豆幼苗外植体细胞内H<,2>O<,2>的产生。在初生根切除后3 h时，与H<,2>O处理相比较，IBA处理显著增加H<,2>O<,2>的浓度，这说明IBA诱导H<,2>O<,2>的产生，暗示IBA对不定根形成的诱导作用可能是通过H<,2>O<,2>实现的。 6．H<,2>O<,2>和NO可能是生长素信号途径中两个平行的下游信号分子。已知NO是IAA诱导的不定根形成过程中的信号分子，但当用DPI抑制H<,2>O<,2>的产生，不仅抑制H<,2>O<,2>对不定根的诱导作用，而且NO诱导的不定根的形成作用也被抑制。这可能暗示H<,2>O<,2>和NO都是生长素信号途径的下游分子，而且H<,2>O<,2>可能位于NO的下游。 7．Ca<'2+>可能是H<,2>O<,2>下游信号分子。胞外Ca<'2+>螯合剂EDTA(1 mM)对绿豆幼苗外植体不定根的形成没有显著地抑制作用，而胞内Ca<'2+>释放抑制剂钌红(10μM)则完全抑制了不定根的形成，且这种抑制作用不能被H<,2>O<,2>和IBA去除，钌红(10μM)也完全抑制H<,2>O<,2>和IBA对不定根形成的诱导作用，这说明Ca<'2+>的流动是不定根形成所需要的，且Ca<'2+>可能是H<,2>O<,2>下游信号分子。 8．cGMP可能是H<,2>O<,2>信号途径的下游成员。GMP环化酶专一性抑制剂LY83583(20μM)对绿豆幼苗外植体不定根的形成与生长有显著抑制作用，LY83583与cGMP类似物8-Br-cGMP、H<,2>O<,2>或IBA共同处理时，8-Br-cGMP、H<,2>O<,2>和IBA能部分逆转LY83583的抑制作用，这说明H<,2>O<,2>和IBA可能促进cGMP的合成，进而促进不定根的形成，cGMP可能是H<,2>O<,2>信号途径的下游成员。 9．MAPK级联参与了生长素响应的植物不定根信号途径，且MAPK信号级联位于H<,2>O<,2>信号的下游。MAPKK专一性抑制剂PD98059(30μM)完全抑制绿豆幼苗外植体不定根的形成，PD98059也完全抑制H<,2>O<,2>和IBA诱导的不定根的形成，表明，MAPK级联参与了生长素响应的植物不定根信号途径，且MAPK信号级联位于H<,2>O<,2>信号的下游。 10．与IBA的作用机理相似，H<,2>O<,2>和IBA处理都能显著降低不定根诱导阶段POD的活性，与这一时段需要较高的IAA浓度相关，而较高的IAA浓度可能在于促进H<,2>O<,2>的产生，启动H<,2>O<,2>信号转导。在绿豆幼苗外植体不定根形成的0 h-48 h内，POD活性的变化基本遵循降-升-降-升的规律，当用H<,2>O<,2>2和IBA处理后3 h时，POD活性显著降低，在3 h-36 h之间，POD活性发生升降的变化，而在36 h后，POD活性升高，这一时段要求较低的IAA浓度以保证不定根原基的长出，较高的POD活性促进内源IAA的分解，降低了内源IAA的浓度，可能也在于降低H<,2>O<,2>的浓度。 11．在绿豆幼苗外植体不定根形成的0 h-48 h阶段，CAT活性保持在一个相对稳定的水平，仅有比较小的变化，而这些变化基本没有统计学意义，这可能暗示，在不定根的诱导与根原基的形成阶段，CAT对细胞内H<,2>O<,2>浓度的变化不如POD敏感。 12．H<,2>O<,2>和IBA处理都能显著降低不定根诱导阶段APX的活性，APX活性的变化规律与POD活性的变化极其相似，在不定根的形成过程中，APX与POD活性的变化具有同等意义，进一步说明H<,2>O<,2>与IBA的作用机理相同。IBA和H<,2>O<,2>处理，在0h-3h时间段降低APX活性，在36h-48h时间段升高APX活性，APX活性在48h时均达到峰值。 综上，我们认为H<,2>O<,2>在绿豆幼苗外植体不定根形成过程中，起信号分子的作用，能够促进不定根形成与生长，生长素对不定根形成的诱导作用可能是通过H<,2>O<,2>而起作用的，H<,2>O<,2>和NO可能是生长素信号途径中的两个平行的下游分子，且H<,2>O<,2>可能位于NO的下游，Ca<'2+>、cGMP和MAPK级联都是H<,2>O<,2>信号途径的下游分子，共同组成生长素信号网络。H<,2>O<,2>和IBA对POD、CAT和APX活性的影响，反映出它们在不定根形成过程中具有相同的作用机理。

目录

声明

摘要

缩写词表

第一章前言

1植物H2O2信号研究进展

1.1 H2O2的产生途径与细胞内平衡

1.2 H2O2信号调控的生理效应

1.3 H2O2的信号转导

1.4 H2O2调控的基因表达

1.5结论与展望

2植物不定根信号转导的研究进展

2.1引言

2.2不定根形成的生物学

2.3不定根形成的调控因子及信号分子

2.4不定根响应基因

2.5生长素响应基因与表达调控

2.6结论

3本研究的目的与意义

第二章H2O2在绿豆幼苗不定根形成和发育中的信号作用

1材料与方法

1.1植物材料的培养

1.2外植体的处理

1.3 H2O2的定量

1.4数据统计与分析

2实验结果

2.1 H2O2对绿豆幼苗外植体不定根形成的作用

2.2 CAT对H2O2诱导的绿豆幼苗外植体不定根形成的影响

2.3 ASA对H2O2诱导的绿豆幼苗外植体不定根形成的影响

2.4 DPI对H2O2诱导的绿豆幼苗外植体不定根形成的影响

2.5 TIBA对H2O2诱导的绿豆幼苗外植体不定根形成的影响

2.6绿豆幼苗外植体不定根形成过程中H2O2浓度的变化

3讨论

第三章绿豆幼苗不定根形成过程中H2O2信号与其它信号分子间的相互作用

1实验方法

2实验结果

2.1 H2O2与NO

2.2 H2O2与cGMP

2.3 H2O2与Ca2+

2.4 H2O2与MPAK

2.5 Ca2+与cGMP和MAPK间的关系

3讨论

第四章绿豆幼苗外植体不定根形成过程中外源H2O2诱导的抗氧化酶的变化及其意义

1材料与方法

1.1植物材料

1.2酶的提取与活性测定

1.3数据统计与分析

2实验结果

2.1 POD活性的变化

2.2 CAT活性的变化

2.3 APX活性的变化

3讨论

3.1 POD活性的变化及其意义

3.2 CAT活性的变化及其意义

3.3 APX活性的变化及其意义

结 论

参考文献

附 录：已发表的部分研究内容

致 谢

完成和发表的论文目录(2006-2007)