拟南芥VSP1蛋白酸性磷酸酶活性及初步晶体学研究

摘要

植物营养贮存蛋白质（Vegetative Storage Proteins，VSP）作为氮源的临时储备形式，在许多植物中被鉴定出来。这类蛋白在不同的营养贮存器官中能积累到很高的程度。作为氨基酸的临时储备，VSP在植物对氮及其他营养物质需要时被降解。VSP最早从大豆的叶中鉴定出来，为了与种子贮存蛋白相区别而被称为营养贮存蛋白质。
　　 拟南芥VSP（包括VSP1和VSP2）是在拟南芥（Arabidopsis thaliana）中发现的大豆VSP的同源蛋白，二者的氨基酸序列相似性达到40％左右。拟南芥VSP主要存在于花和芽中，能被机械创伤，茉莉酸，昆虫的食草作用，磷酸盐的缺乏，渗透和营养压力诱导。与大豆VSP相比，拟南芥VSP2具有明显的酸性磷酸酶活性，在分类上属于HAD超家族。重组的拟南芥VSP2还具有抗虫的活性，并与其酸性磷酸酶性质有关。
　　 然而，拟南芥VSP蛋白的结构尚未有报道，阻碍了人们对其催化机理的全面细致的了解。我们对重组VSP1进行了酶学和晶体学研究，这为VSP1结构的解析，阐明其催化机理打下基础。
　　 将拟南芥VSP1-pET-22b质粒转化E. Coli BL21(DE3)感受态细胞，并得到高效表达。经过Ni-NTA亲和层析，得到电泳纯的VSP1蛋白。对重组VSP1进行了酸性磷酸酶性质研究，包括二价铜离子与镁离子的催化差异，底物特异性，抑制剂的影响。不同浓度的二价铜离子与镁离子对VSP1催化活性的影响有所不同。Cu2+浓度为1mM时，VSP1活性最大，然后呈下降趋势；而Mg2+浓度为10mM时，VSP1活性最大，随后基本保持不变，提示两种离子的激活机制可能不同。VSP1显示狭窄的底物特异性，磷酸芳基酯pNPP和MUP是最易催化的底物，而其他底物的水解速率都在pNPP水解速率的5％以下。磷酸盐对VSP1无明显抑制作用，EDTA，钼酸盐和钒酸盐对VSP1具有显著的抑制作用。Asp124突变体完全丧失酸性磷酸酶活性，表明Asp124为催化功能所必须。
　　 利用坐滴气相扩散法并采用Hampton Research CrystAlScreen I & II和Emerald BioSystems Wizard I & II在287 K进行重组VSP1蛋白晶体筛选，在CrystAlScreen I的40号条件中得到蛋白晶体，衍射分辨率达到1.9 ?。VSP1晶体初步数据显示空间群为C2，晶胞参数为a=123.1?，b=48.4 ?，c=85.6 ?，α=γ=90°，β=116.3°。

目录

文摘

英文文摘

论文说明:缩略词表

声明

第一部分 综 述

第二部分 材料与方法

第三部分 实验结果

第四部分 讨论

第五部分 结论

参考文献

附 录

致 谢

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