PCH与PH光学异构体的药效及药理学研究与pGEX-6p-2-Notch3<'41-656>及pGEX-6p-2-Notch3<'228-656>载体的构建与表达及其单克隆抗体的制备

摘要

盐酸苯环壬酯(phencynonate hydrochloride，PCH)和盐酸戊乙奎醚(penehyclidinehydrochloride，PH)是军事医学科学院毒物药物研究所发明的新型抗胆碱药，盐酸苯环壬酯对晕动病(motion sickness，MS)具有防治作用，但盐酸苯环壬酯的不良反应主要是口干和思睡，盐酸苯环壬酯分子结构中含有一个手性中心，具有R(-)-和S(+)-型两个光学异构体。盐酸苯环壬酯的左旋体[R(-)-PCH]为其活性异构体，与M受体的亲和性强于消旋体和右旋体S(+)-PCH，因此，评价盐酸苯环壬酯及其光学异构体对晕动病的防治作用，在兔逆向转圈综合症模型中盐酸苯环壬酯左旋体[R(-)-PCH]的ED50值为4.01，外消旋体的ED50值为8.94，两者的ED50值比为1∶2.23，而盐酸苯环壬酯的右旋体[S(+)-PCHl在34mg/kg没有表现出明显的抗晕动病效果(p>0.05)；在家猫晕动病样综合症模型中，盐酸苯环壬酯左旋体[R(-)-PCH]ED50值为0.07，外消旋体的ED50值为0.58，两者的ED50值比为1∶8.06，而右旋体[S(+)-PCH]在3.0mg/kg没有表现出明显的抗晕动病效果(p>0.05)。盐酸苯环壬酯的左旋体抗晕动病效果明显强于外消旋体和右旋，将来可能会成为抗晕动病的新药．盐酸戊乙奎醚具有两个手性中心，四个手性化合物RR’，RS’，SR’和SS’，其中RR’和SR’为M受体的活性异构体，运用稳定转染表达人M1，M3及M4亚型基因的中国仓鼠卵细胞，通过放射性配基一受体结合实验，研究盐酸戊乙奎醚两个活性异构体RR’和SR’对M受体亚型M1，M3和M4的选择性作用，SR’-PH与M1，M3，M4亚型的亲和性：M4(Ki=9.1nM)>Ml(Ki=11.412nM)>M3(Ki=53.668 nM)，RR’-PH与M受体亚型的亲和性：M3(Ki=0.022nM)>M1(Ki=0.091nM)>M4(Ki=0.136nM)。SR’-PH对M4受体亚型的选择性相对较M1和M3高；RR’-PH对M3受体亚型的选择性相对较M1和M4高。 CADASIL由Notch3基因突变引起，Notch3基因定位在第19号染色体短臂上，由33个外显子组成，其编码的Notch3受体有2321个氨基酸残基。70﹪～80﹪的Notch3基因突变发生在外显子3和4，PCR扩增Notch3<'41-656>及Notch3<'228-656>NOtch3228-656基因，将其插入pGEx一6p一2载体中，成功构建出重组原核表达载体pGEX一6p一2一Notch3”娟拍及pGEX-6p-2-Notch3<'228-656>，将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，经1mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)20℃，14h诱导，SDS-PAGE及凝胶扫描分析GST融合蛋白的表达，纯化目的蛋白，免疫BABl/C小鼠，制备单克隆抗体，现准备细胞融合。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略词

声明

前言

第一章R(-)-盐酸苯环壬酯光学异构体抗晕动病药效学研究

一、材料和方法

二、实验结果

三、讨论

第二章盐酸戊乙奎醚活性异构体对M受体亚型选择性研究

一、实验材料

二、细胞培养

三、配体结合实验

四、实验结果

五、讨论

第三章pGEX-6p-2-Notch341-656及pGEX-6p-2-Notch3228-656载体的构建与表达及其单克隆抗体的制备

一、实验材料

二、构建重组质粒pGex-6p-2-Notch341-656、pGex-6p-2-Notch3228-656

三、融合蛋白表达

四、单克隆抗体的制备

五、实验结果

六、讨论

致谢

参考文献