水稻细菌性条斑病抗性QTL qBlsr5a的精细定位及候选基因的表达分析

摘要

水稻细菌性条斑病(Xanthmonas campestris pv.Oryzieola)，简称水稻细条病，是水稻上一种重要的检疫性细菌病害。该病主要危害水稻叶片，水稻受侵染后，叶片变黄甚至枯死，空秕粒增多，千粒重降低，一般可减产10~20％，严重时达40％。目前，细条病已成为南方稻区的主要病害，成为影响水稻产量及品质的重要限制因子。相对于水稻另两大病害(白叶枯病和稻瘟病)，水稻对细条病的抗性属于典型的数量性状，不存在主基因抗性，现有种质资源中也未发现对该病表现免疫的品种。因此，深入挖掘现有资源中的数量抗性基因座(Quanfitative resistance locuS，QRL)，不仅具有重要的实践应用价值，而且可以对数量抗病性的机制研究提供帮助。 目前，在水稻中已报道13个细条病抗性QTL，其中Tang等以高抗细条病品种Acc8558和高感细条病品种H359为亲本构建的重组自交系群体，定位了11个细条病抗性QTL，其中位于5号染色体短臂上的QTL qBlsr5a(其抗病等位基因来自抗病亲本Acc8558)对表型变异贡献率最大，并在后续研究中得到了证实。这说明qBlsrSa在水稻细条病抗性的遗传改良上具有较大的应用前景。本研究在前人工作的基础上，对qBlsr5a进行更深入的研究。 分别以Acc8558和H359为供体亲本和受体亲本，通过回交和分子标记辅助选择，育成了只渗入供体5号染色体短臂含抗性QTL qBlsr5a的区段的近等基因系H359-BLSR5a。进一步将该近等基因系与H359杂交，建立了一个大的F2群体(2,265单株)。采用选择极端表型个体并验证其后代(F2：3)株系的方法，在F2群体中鉴定出目标QTL为抗病纯合基因型的个体。通过对这些个体进行分子标记基因型检测和连锁分析，将qBlsr5a定位在SSR标记RM153和RM159之间，大约2.4 cM或290 kb的范围内。 利用Affymetrix的基因芯片对抗病品种Acc8558和感病品种H359中受细条病菌侵染调控的基因进行高通量的检测。在两品种中共检测到956个差异表达基因，其中12个基因在两品种中一致上调，54个基因在两品种中一致下调，20个基因在两品种中表达变化方向相反。对差异表达基因的基因本性(GO)、代谢路径和启动子进行了分析。比较所有差异基因与已报道的13个抗性QTL的位置关系，发现有30个差异表达基因的位置与这些抗性QTL吻合，但在qBlsr5a的定位区间(290 kb)内只检测到一个差异表达基因(LOC Os05g01330)，且功能未知。 在水稻GTamene(http：//www.gramene.org/Oryza-sativa- japonica/contigview)及TIGR(http：//www.tigr.org/tdb/e2k1/osa1/GO.retrieval.shtml)数据库中查询，发现qBlsr5a的精细定位区间(290 kb)内共有51个预测基因，其中33个(64.7％)有功能注释。根据这些功能注释，本文选择了19个预测基因(包括那个基因芯片检测到的差异表达基因)进行表达分析，其中3个预测编码多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白前体(PGIP)；1个编码锚蛋白1(ankyrin-1)；1个编码转录因子ILAγ亚基(TFIIAγ)；1个编码与K蛋白1互作的锌指蛋白(ZIK1)；还有2个含锌指结构。以H359和H359-BLSR5a为材料，在病原菌接种后的不同时期对这19个基因进行半定量RT-PCR分析。 结果表明，有4个预测基因在两品系中都没有表达，7个预测基因在两品系中在病菌侵染前后表达都没有变化，其余8个预测基因对病原菌侵染有反应。其中6个基因的表达趋势在两品种中基本一致(5个表达上调，1个表达下调)。1个基因(LOC _Os05g01380)在H359中接种前后没有变化，但在近等基因系H359-BLSR5a中接种6h时表达量开始增强，到24h时表达量达最到高。最令人感兴趣的是预测基因LOC Os0501444，它在H359中没有表达，而在H359-BLSR5a中被诱导表达，且在接种6h时表达量达到最高。该基因编码区长度为1，206 bp，无内含子，预测编码多聚半乳糖醛酸酶抑制前体蛋白(PGIP)，已知PGIP参与植物的多种抗病反应。因此看来，该基因是qBlsr5a的一个重要的候选基因。

目录

论文说明：缩略词(Abbreviations)

声明

前言

文献综述

1植物抗病性研究进展

1.1植物的抗病性反应

1.2植物R基因介导的质量抗病性

1.3植物抗病基因的克隆

1.4植物的防卫基因

1.5植物抗病基因传导途径

2数量抗病性的研究进展

2.1数量抗病性

2.2QRL抗性的可能机理

3QTL定位

3.1QTL定位原理和方法

3.2QTL定位的作图群体

3.3影响QTL定位的因素

3.4针对QRL获得数量抗病性状值准确性的主要方法

3.5分子标记(molecular marker)

4水稻细菌性条斑病及其相关的抗性研究

4.1水稻细菌性条斑病

4.2水稻细条病的抗性鉴定与抗源筛选

4.3水稻细条病的抗性生理研究

4.4水稻对细条病抗性的遗传和QRL定位研究

4.5水稻搞细条病QTL的标记辅助育种

第1章抗性QTLqBlsr5a的精细定位

1.1材料和方法

1.1.1水稻材料

1.1.2细条病菌株及培养

1.1.3含单个抗性QTLqBlsr5a近等基因系的建立及抗性鉴定

1.1.4作图群体的建立和细条病抗性鉴定

1.1.5分子标记发展

1.1.6SSR标记分析和遗传连锁图构建

1.2结果与分析

1.2.1含单个抗性QTL近等基因系的建立

1.2.2H359-BLSR5a近等基因系的农艺性状及抗性表现

1.2.2作图群体的构建

1.3讨论

1.3.1水稻细条病

1.3.2菌株的选择培养和接菌的方法及接菌条件的控制

1.3.3SSR标记的选择

1.3.4qBlsr5a的精细定位

第2章利用基因芯片检测水稻细条病抗性相关基因

2.1材料和方法

2.1.1水稻材料

2.1.2细条病菌株及培养

2.1.3材料的种植与接菌

2.1.4总RNA提取、检测及基因芯片分析

2.1.5半定量PCR

2.2结果与分析

2.2.1RNA质量检测

2.2.2两品种中细条病菌诱导的差异表达基因

2.2.3半定量RT-PCR结果

2.2.4差异表达基因与抗性QTL的对应关系

2.3讨论

2.3.1细条病抗性的复杂性

2.3.2本研究下一步工作的假设

第3章qBlsr5a的候选基因分析

3.1材料与方法

3.1.1供试水稻材料

3.1.2接菌菌株及培养

3.1.3材料的种植与接菌

3.1.4qBlsr5a定位区间内候选基因的挑选

3.1.5RNA提取与反转录反应

3.1.6预测基因的表达分析

3.2结果与分析

3.2.1RNA质量检测

3.2.2qBlsr5a的物理区间内的基因

3.2.3候选基因的表达分析

3.3讨论

3.3.1qBlsr5a的候选基因分析

3.3.2病原菌与水稻的互作

3.3.3半定量RT-PCR技术

3.3.4qBlsr5a抗性的可能机理

全文结论及下一步工作计划

参考文献

附录

致谢