吴茱萸碱通过AMPK/mTOR信号通路激活自噬抑制结肠癌细胞增殖的研究

摘要

结肠癌是最常见的胃肠道肿瘤，尽管结肠癌的治疗方法在手术、化疗和新型分子靶向药物的开发等方面已经取得了巨大的成就，但结肠癌的发病率却依然在不断上升。目前，结肠癌的早期诊断和治疗策略可以提高患者的总体生存率，手术切除后同时辅助化疗极大地提高了结肠癌患者的临床疗效。然而对于被诊断为晚期疾病的患者，结肠癌常常发生转移，而肿瘤转移是大多数肿瘤患者死亡的主要原因。转移性结肠癌的5年生存率仅为10-15%，而非转移性结肠癌的5年生存率为40-90%。因此，早期筛查和新颖的治疗方法对于改善结肠癌的预后至关重要。　　长期以来，吴茱萸碱（Evodiamine，Evo）等中草药有效成分一直被认为是治疗各种疾病的有效方法。虽然其抗肿瘤活性已在多种肿瘤疾病中被证明，但在结肠癌组织中，吴茱萸碱的影响及相关机制的报道却为数不多。　　自噬是Ⅱ型程序性细胞死亡，其特征是线粒体、核糖体和内质网等细胞成分的降解以及大量自噬体的形成。自噬是在应激刺激下被激活的，包括饥饿及细胞内应激等。在细胞自噬过程中，多余的、受损的或老化的细胞器和细胞被隔离、降解和回收。自噬的激活还涉及多种疾病，包括神经退行性病变、自身免疫性疾病、感染和癌症等。目前，自噬在肿瘤中的作用备受关注，自噬诱导的细胞死亡作用可能导致肿瘤细胞的生长抑制，从而抑制肿瘤的发生。　　AMPK(Adenosine 5‘-monophosphate (AMP)-activated protein kinase)即单磷酸腺苷活化蛋白激酶，其是一种主要的细胞传感器，能够将多种细胞功能和过程与能量利用联系起来。AMPK是一种进化保守的蛋白激酶，既存在于单细胞生物中，如面包酵母；也存在于更复杂的多细胞真核生物中，如哺乳动物。AMPK信号通路除了参与主要的代谢功能外，还参与许多生理过程，如细胞骨架重塑和转录控制或调控基本的细胞过程，如凋亡或自噬等。研究表明，Evo能够通过激活AMPK来发挥其生物学功能。因此，本研究提出假说：Evo通过激活AMPK信号通路，激活自噬，进而在体内体外抑制结肠癌细胞增殖。　　方法　　体外实验：培养人结肠癌细胞株HCT-116，分别加入Evo 0、1.5、3、6、12 μmol·L-1培养48 h，CCK-8法、细胞克隆形成实验及EdU染色检测Evo对HCT-116生存活性的影响；MDC法、RFP-GFP-LC3腺病毒等检测细胞自噬；DHE 检测细胞内活性氧的产生；RT-PCR 和Western Blot检测不同浓度的Evo（0、3、6 μmol·L-1）诱导HCT-116细胞48h后，细胞中LC3、p62、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR等相关蛋白的表达情况；Evo（6 μmol/L）分别与自噬抑制剂3-MA （3-Methyladenine）和凋亡抑制剂Z-DEVD-FMK共同作用48 h后， Western Blot检测细胞内自噬相关信号通路及凋亡相关因子的表达。　　体内实验：4周龄的Balb/c裸小鼠二十只，随机分为两组，两组小鼠均在右下腹部接种HCT-116细胞，待瘤体直径约0.5cm后，每日对实验组小鼠给予Evo（10mg/Kg）灌胃治疗，对照组灌胃生理盐水，定期观察小鼠瘤体及体重数据。治疗3w后处死小鼠，收集相关标本，计算瘤体体积及重量。HE染色观察瘤体内细胞形态，IHC和Western Blot检测LC3、p62、AMPK、p-AMPK、mTOR、p-mTOR蛋白的表达变化。　　结果　　1.在体外，不同浓度的Evo（0、1.5、3、6、12、24、48、96 μmol·L-1）作用于HCT-116细胞48h后，细胞的增殖抑制作用明显（P＜0.05），在一定范围内呈浓度依赖性；同时能明显减少细胞克隆的形成。给予凋亡抑制剂后，细胞增殖及克隆形成被进一步抑制。　　2. Evo可明显增加细胞内自噬体及ROS的产生，上调细胞内LC3、同时抑制p62等蛋白的表达，同时能上调AMPK/mTOR信号通路关键蛋白的表达。当给予自噬抑制剂后，细胞凋亡信号通路被进一步激活，反之给予凋亡抑制剂后，细胞自噬信号被进一步激活。　　3.在体内，Evo用药组的荷瘤重较模型组（0.71±0.22g VS 3.51±0.6g）明显较低，差异有统计学意义（P＜0.01）；Evo 用药组的瘤体体积远低于模型组（324.21±22.36mm3 VS 1149.31±158.44mm3）（P＜0.01）；HE结果提示：Evo组小鼠瘤体细胞排列紊乱，细胞碎片较多，细胞核固缩明显。　　4. 体外实验与体内实验相吻合，Evo 用药组小鼠荷瘤细胞中 LC3Ⅱ/Ⅰ比例上调、p62蛋白表达水平降低，同时AMPK/mTOR信号通路被激活，细胞内自噬被激活。　　结论：　　1. Evo具有明显抑制HCT-116细胞增殖的作用；在细胞凋亡被抑制时能够通过激活自噬，进一步抑制结肠癌细胞的增殖。　　2. 体内外实验表明，Evo 能够通过激活 AMPK/mTOR 信号通路，进而激活自噬，抑制结肠癌HCT-116细胞增殖。

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英汉缩略语名词对照

前言

第一部分 吴茱萸碱在体内体外抑制结肠癌细胞增殖

1材料与方法

1.1 材料

1.2 仪器

1.3 方法

2结果

2.1 Evo对人结肠癌荷瘤小鼠瘤体形成的影响

2.2 Evo对人结肠癌荷瘤小鼠瘤体细胞形态的影响

2.3 Evo对人结肠癌荷瘤小鼠瘤体细胞增殖的影响

2.4 Evo对人结肠癌HCT-116细胞增殖的影响

2.5 Evo对人结肠癌HCT-116细胞克隆形成的影响

2.6 Evo抑制HCT-116细胞增殖

2.7 Evo+Z-DEVD-FMK对HCT-116细胞增殖的影响

3讨论

第二部分 吴茱萸碱在体内体外激活结肠癌细胞自噬

1材料与方法

1.1 材料

1.2 仪器

1.3 方法

2结果

2.1 Evo对HCT-116细胞自噬的影响

2.2 Evo在体内对HCT-116细胞自噬的影响

2.3 Evo对HCT-116细胞内活性氧产生的影响

2.4 Evo对HCT-116细胞及荷瘤小鼠瘤体内AMPK/mTOR信号通路的影响

2.5 Evo联合自噬或凋亡抑制剂对细胞自噬和凋亡相关蛋白表达的影响

3讨论

全文总结

参考文献

文献综述:癌症中mTOR信号的作用及mTOR抑制剂在实体肿瘤靶向治疗

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文