吴茱萸碱衍生物及其纳米制剂对H1688小细胞肺癌细胞株抗肿瘤作用研究

摘要

【目的】 研究吴茱萸碱的两种不同衍生物：吴茱萸碱硝基化合物（Evodiamine nitro compound, END）和吴茱萸碱氨基衍生物（Evodiamine amino derivative, EAD）以及它们的纳米制剂吴茱萸碱硝基衍生物磷脂复合物（Evodiamine nitro derivative complex, ENPD）和吴茱萸碱氨基衍生物磷脂复合物（Evodiamine amino derivative complex, EAPD）对小细胞肺癌H1688细胞株的抗肿瘤活性及作用机制。　　【方法】体外培养 H1688 小细胞肺癌细胞株，在不同浓度 EVO、END、EAD、ENPD、EAPD 作用后和相同浓度不同作用时间作用后，运用MTT法检测细胞存活率、用流式细胞术考察H1688细胞凋亡的情况和有丝分裂周期。荧光探针染色考察H1688细胞内活性氧、钙离子浓度和线粒体膜电位变化。并用细胞器共定位等方法观察荧光标记的纳米磷脂复合物在细胞中被摄取的行为和主要摄取部位。另用western blot检测caspase 12、caspase 9、caspase 3、cyt C等凋亡相关蛋白及chop、bim等内质网应激相关蛋白和自噬标志蛋白LC 3的表达。继而采用裸鼠体内成瘤、H&E染色等方法进一步考察吴茱萸碱衍生物及其纳米磷脂复合物对小细胞肺癌细胞株H1688细胞的体内抗肿瘤作用。　　【结果】 MTT结果显示，END与EAD及其纳米制剂ENPD与EAPD都对H1688小细胞肺癌细胞有抑制作用，且呈时间和浓度依赖性，以END及ENPD作用最强。流式细胞术检测发现，END、EAD、ENPD、EAPD 均可诱导 H1688 细胞发生凋亡，且阻滞其有丝分裂于G2/M期。用以上方法考察END、EAD、ENPD、EAPD对H1688细胞的效应后，进一步检测凋亡相关指标发现经以上药物处理后H1688细胞内线粒体膜电位下降，活性氧升高及钙离子浓度升高，显示出明显的凋亡现象。Western blot结果显示，END、EAD处理后，H1688细胞的caspase 3/ 9/ 12等蛋白表达上调不明显，但ENPD和EAPD作用后caspase 3/ 9/ 12明显上调，且Cyt C释放增加，同时自噬蛋白LC 3Ⅰ/LC3 Ⅱ值在EVO、END、EAD、ENPD、EAPD处理后显著降低。以上结果说明END、EAD、ENPD、EAPD均能通过线粒体途径诱导H1688细胞发生凋亡但END与EAD效果远弱于ENPD和EAPD，同时可诱导自噬发生。对纳米磷脂复合物在细胞中的行为进行考察后可知， ENPD和EAPD主要通过细胞内质网摄取，并聚集于胞质中，使ENPD和 EAPD 更多聚集于内质网附近诱导内质网应激发生。裸鼠体内成瘤实验显示各化合物均能抑制裸鼠体重下降和体内肿瘤生长。　　【结论】两种不同的吴茱萸碱衍生物END和EAD都具有抗小细胞肺癌细胞H1688的抗肿瘤活性，且抗肿瘤活性比母体药物EVO更显著，END作用最强。纳米磷脂复合物ENPD和EAPD增强了药物抗肿瘤作用。各化合物的主要抗肿瘤机制均是通过线粒体途径诱导 H1688细胞发生凋亡，也与药物诱导自噬增强有关。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

参考文献

第一部分 END、EAD、ENPD和EAPD抗H1688小细胞肺癌细胞株的抗肿瘤活性

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 细胞存活率

3 小结

第二部分 END、EAD、ENPD和EAPD对H1688细胞凋亡与周期的影响

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 凋亡检测

2.2 周期检测

3 小结

第三部分 END、EAD、ENPD和EAPD对细胞内活性氧、钙离子浓度和线粒体膜电位的影响

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1细胞活性氧检测

2.2细胞钙离子浓度检测

2.3细胞线粒体膜电位检测

3 小结

第四部分 纳米磷脂复合物在细胞内行为的考察

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 细胞摄取实验

2.2 细胞共定位实验

3 小结

第五部分 END、EAD、ENPD、EAPD对H1688凋亡或自噬相关蛋白表达的影响

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

3 小结

第六部分 体内抗肿瘤活性研究及安全性初步评价

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 裸鼠体重、肿瘤体积与脏器系数变化

3 小结

讨论

参考文献

全文总结

文献综述:吴茱萸碱抗肿瘤作用的研究进展

攻读学位期间发表的文章

致谢