利用生物信息学分析高橄榄油饮食促进宫颈癌移植瘤生长的核心基因及通路

摘要

目的：借助生物信息学及相关分析工具，对不同膳食油脂条件（高橄榄油饮食和对照饮食）喂养下的裸鼠宫颈癌转移瘤组织进行转录组测序（RNA-seq）分析，筛出与宫颈癌移植瘤增殖相关的差异表达基因，对这些上调或下调的差异基因进行相关功能注释分析及通路分析，通过以上这些生信分析结果，对差异表达基因可能的生物功能加以预测。通过相应生物信息学软件及算法在这些差异表达基因中筛选出核心基因，或是感兴趣的目的基因，以期找到能够解释高橄榄油饮食促进宫颈癌移植瘤生长的关键基因，并对其进行进一步深入研究。　　方法：第一部分：选取 4 周龄 BALB/c 背景的裸鼠，随机分为对照饮食组（Control Diet, CD）和高橄榄油饮食组（High Olive Oil Diet, OD），并用Hela细胞在裸鼠皮下注射造模。造模6周后收集肿瘤样本，并进行拍照及测量。并对肿瘤病理切片进行HE和PCNA染色。在体外利用橄榄油中主要成分油酸处理Hela细胞，利用长时间动态细胞成像及数据分析系统对油酸处理条件下细胞增殖状态进行动态检测，并利用EdU实验检测油酸处理条件下细胞群中进行处于DNA合成状态的细胞比例。第二部分：利用高通量转录组测序技术筛选对照组和高橄榄油饮食组移植瘤样本中DEGs（Differentially Expressed Genes），然后用DAVID数据库对上调和下调的基因分别进行GO（Gene Ontology）功能注释和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析，探索这些差异基因可能的相关的生物学功能及关键通路信息。为了进一步挖掘DEGs之间的相互联系，应用STRING数据库对差异基因进行蛋白互作网络（Protein-Protein Interaction, PPI）的构建，并将分析结果数据通过Cytoscape软件将其可视化并利用其CytoNCA插件对 PPI 网络中每个节点（代表一个基因）的网络拓扑分析（节点度）进行计算，得到处于 PPI 网络中最核心地位的一组枢纽基因（ Hub gene），同时用MCODE插件寻找PPI网络中的重要模块，根据设置参数得到三个重要模块及其包含的核心蛋白。最后，为验证转录组测序筛选的 DEGs 准确性，从生信分析得到一组核心基因组中，随机选取了5个DEGs，采用RT-qPCR方法验证了它们两组样本组织中mRNA表达水平差异。　　结果：第一部分：裸鼠皮下成瘤实验发现高橄榄油饮食组皮下肿瘤体积及重量均超过对照饮食组6倍（P＜0.05），同时肿瘤组织HE染色后可见 OD 组切片呈现更高的异质性，免疫组化分析揭示 OD 组中PCNA 阳性细胞的显著增加。长时间动态细胞成像及数据分析系统对Hela 细胞增殖状态监测显示 48h 时，油酸处理组细胞融合度为（72.8±1.6）%，较对照组（64.7±5.5）%显著增高（P＜0.05），EdU阳性细胞阳性率在油酸处理组为（36.6±1.1）%，较对照组（31.9±1.1）%明显增加（P＜0.05）。第二部分：不同膳食脂质喂养条件下两组肿瘤样本的转录组测序总共得到648个DEGs，其中包括155个上调的DEGs和493个下调的DEGs。GO功能分析和KEGG通路途径富集分析这些DEGs主要富集在转录调控（如EGR1和FOXN2）和细胞增殖（如TGFB2和COL4A3）。用STRING在线蛋白质互作数据库将符合标准的DEGs构建成PPI网络后，利用Cytoscape的MCODE插件得出三个重要的亚网络，并且根据节点度的大小（节点度＞8），由高到低得到15个核心蛋白，并将这15个核心蛋白映射到模块上，可见相当一部分核心蛋白处于上述的模块中。通过实时定量PCR分析确认包括JUN，TIMP3， OAS1，OASL和EGR1的中枢基因。RT-qPCR检测的5个DEGs（JUN， TIMP3，OAS1，OASL和EGR1）的变化趋势和转录组测序结果一致。　　结论：高橄榄油饮食喂养在体内有助于宫颈癌Hela细胞生长，并且油酸在体外可提升其的增殖潜能，随后全面的生物信息学分析显示，不同膳食喂养条件下的小鼠移植瘤组织之间存在明显的基因表达模式差异，这种表达模式差异具体体现在一组重要的核心基因的表达差异及相关信号通路变化，这些核心基因为我们进一步研究宫颈癌潜在的机制提供了的方向，而且它们有望成为宫颈癌诊断和治疗潜在的靶点，当然这些核心基因的具体机制我们仍然需要通过进一步的实验研究来证明。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分 橄榄油/油酸对Hela宫颈癌细胞增殖的影响

1实验材料及方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果

2.1高橄榄油饮食喂养加剧Hela宫颈癌细胞裸鼠皮下肿瘤生长

2.2高橄榄油饮食喂养组肿瘤具有更高的异型性和增殖状态

2.3体外实验油酸促进宫颈癌Hela细胞增殖

3讨论

第二部分 RNA-seq寻找肿瘤样本DEGs及整合的生物信息学分析

1实验材料与方法

1.1实验材料

1.2实验方法

2结果

2.1不同膳食喂养下宫颈癌肿瘤组织差异基因表达情况

2.2 DEGs的GO本体及KEGG通路分析

2.3 PPI网络及基因中心性分析

2.4通过RT-qPCR验证差异基因表达水平

3讨论

全文总结

参考文献

文献综述:宫颈癌临床实践中测序技术的相关应用

致谢

攻读硕士学位期间发表的论文

攻读硕士学位期间参加的学术会议