分离、鉴定CD133+人肝癌干细胞以及131Ⅰ-CD133mAb在体内外对其生物学效应的影响

摘要

实验目的：分离、鉴定CD133+人肝癌干细胞以及利用氯胺T法制备131I-CD133mAb，利用其放射免疫作用，在体内外研究131I-CD133mAb对CD133+人肝癌干细胞生物学效应的影响，讨论将其用于肝癌放射免疫治疗的可行性。　　第一部分分离、鉴定CD133+人肝癌干细胞　　实验方法：利用流式细胞仪从肝癌细胞系Huh-7、HepG2两种细胞中检测CD133表达高的细胞进行磁珠分选，采用磁珠分选技术分选出CD133+Huh-7细胞，利用流式细胞仪检测分选出的CD133+Huh-7细胞CD133的表达率;将分选出的CD133+Huh-7细胞和CD133-Huh-7细胞进行体外成球实验、克隆实验、体内BALA/c裸鼠成瘤能力对比。　　实验结果:利用流式细胞仪检测出两种肝癌细胞系Huh-7、HepG2的CD133表达率分别为18.80％和5.2％，故选择Huh-7细胞进行磁珠分选，利用流式分选仪检测出分选后的CD133+Huh-7细胞的CD133表达率为99.28％。在体外成球实验中CD133+Huh-7细胞悬浮于含生长因子的无血清培养基中，并逐渐成球生长，而CD133-Huh-7细胞在相同条件下死亡。克隆形成实验显示CD133+Huh-7细胞比CD133-Huh-7细胞表现出更高的克隆形成能力(P＜0.01)。体内成瘤实验结果显示在4周后，BALA/c裸鼠前臂皮下，CD133+Huh-7细胞在细胞浓度仅为1×103/200ul时能形成移植瘤，而相同浓度下，CD133-Huh-7细胞也未形成移植瘤。　　实验结论:通过实验结果表明，采用磁珠分选技术所分选得到的CD133+Huh-7细胞比CD133-Huh-7细胞，具有更强的体外成球能力、克隆形成能力以及体内成瘤能力，故CD133+ Huh-7细胞是具有干细胞特性的肝癌细胞。　　第二部分 CD133mAb放射性核素的标记和鉴定　　实验方法:采用氯胺T法将131I标记CD133mAb，采用纸层析法进行标记率的测定，经Sephadex G50层析柱将标记好的131I-CD133mAb进行纯化，测定比活度和放射化学纯度。在37℃条件下将纯化的131I-CD133mAb与人血清混合，分别孵育24、48、72 h后测定其放射化学纯度的变化。将131I-CD133mAb与CD133+Huh-7细胞于37℃孵育箱中孵育30、60、90、120min，测定其细胞免疫结合率。　　实验结果:用纸层析法测定标记好的131I-CD133mAb的标记率为87.92％，经Sephadex G50层析柱纯化后131I-CD133mAb的放射化学纯度为97.54％，放射性比活度为0.91 MBq/μg。将纯化的131I-CD133mAb与新鲜人血清充分混合后，在37℃中分别孵育24、48、72 h后，测得的放射性化学纯度依次为95.43％、93.06％和90.57％，每个时间点131I-CD133mAb液的放射化学纯度均高于90％，差异无显著意义(P＜0.05)。131I-CD133mAb与CD133+Huh-7细胞结合后，30min时免疫结合率为(38.49±0.91)％，60min时免疫结合率为(56.36±0.45)％，90min时免疫结合率为(69.10±0.55)％，120min时免疫结合率为(64.80±0.35)％，且均高于与CD133-Huh-7细胞的免疫结合率。　　实验结论:通过氯胺T法制备的131I-CD133mAb，其标记率较高，稳定性较好、细胞免疫活性较高。　　第三部分131I-CD133mAb在体外对CD133+人肝癌干细胞抑制作用的研究　　实验方法:先将131I-CD133mAb、131I、CD133mAb等倍比稀释成5个浓度，9.6ug/100uL、4.8ug/100uL、2.4ug/100uL、1.2ug/100uL、0.6ug/100uL，分别加入第一部分中分选出的CD133+Huh-7细胞中，作用于24h，采用MTT法检测各组对CD133+Huh-7细胞生长抑制的最适剂量;再取CD133+Huh-7细胞、Huh-7细胞和HepG2细胞进行实验，将每种细胞分成四组（131I-CD133mAb组，131I组，CD133mAb组,131I+CD133mAb组），取131I浓度约4.8 MBq/mL，CD133mAb浓度约4.8ug/100uL，分别作用24h、48h、72h后，采用MTT法检测各细胞组抑制率;采用流式细胞仪检测131I-CD133mAb分别作用CD133+Huh-7细胞、Huh-7细胞和HepG2细胞72h后，三种细胞凋亡和细胞周期的变化;　　实验结果:在浓度筛选实验中，131I-CD133mAb，131I和CD133mAb三者对CD133+Huh-7细胞的生长均有不同程度的抑制作用，当131I放射性浓度为4.8 MBq/100μl，CD133 mAb浓度为4.8μg/100μl时，131I-CD133mAb组，131I组和CD133mAb组三组之间的两两差距最大(p＜0.05)。选取131I浓度约4.8 MBq/mL，CD133mAb浓度约4.8ug/100uL进行实验，MTT法检测示131I-CD133mAb对CD133+Huh-7细胞的抑制率明显高于131I组，CD133mAb组，131I+CD133mAb组，当24h，48h和72h时抑制率分别为（30.69±0.11）％、（46.54±0.70）％和（63.47±0.96）％。流式细胞仪检测示131I-CD133mAb作用CD133+Huh-7细胞72h后，CD133+Huh-7细胞组中凋亡率（早期凋亡和晚期凋亡之和）为31.21％，明显高于Huh-7细胞组的12.09％和HepG2细胞组的6.66％(p＜0.05);CD133+Huh-7细胞组中G0/G1期由81.02％降至26.25％，则大部分细胞进入G2期和S期，逐渐凋亡。CD133+-Huh-7细胞组G0/G1期减少了54.77％，明显高于Huh-7细胞组19.04％和HepG2细胞组10.32％(p＜0.05)。　　实验结论:所有实验结果显示，131I-CD133mAb对CD133+Huh-7细胞的抑制作用最强，明显高于131I和CD133mAb对CD133+Huh-7细胞的抑制作用，而CD133mAb的抑制作用则最弱。且131I-CD133mAb对高表达CD133的CD133+Huh-7细胞有特异性靶向抑制作用。　　第四部分131I-CD133mAb在体内对荷人肝癌干细胞裸鼠模型的抑制作用的研究　　实验方法:将细胞浓度为5×104/200μl的CD133+Huh-7细胞和Huh-7细胞种植于BLAB/c裸鼠皮下，待移植瘤形成后，做免疫组化染色，在显微镜下观察两种移植瘤组织中CD133表达的差异。将5×104/200μl的CD133+Huh-7细胞形成的移植瘤，分为生理盐水对照组、131I-CD133mAb组、131I组和CD133mAb组，通过尾静脉分别注射生理盐水100ul、131I放射性强度约4.8MBq/100ul和CD133mAb浓度约4.8ug/100ul相关液，测量作用28天后移植瘤的体积和肿瘤，测其肿瘤抑制率，将各组移植瘤进行HE染色后，观察其组织学变化。　　实验结果:免疫组化染色可知CD133+Huh-7细胞形成的移植瘤组织中CD133表达量比Huh-7细胞形成的移植瘤组织表达稍高。131I-CD133mAb组移植瘤体积（0.19±0.01）cm3明显小于其余各组，肿瘤重量（1.66±0.07）g明显轻于其余各组，抑瘤率（85.21±2.53）％明显高于其余两组，差异具有统计学意义(p＜0.05)。HE染色结果显示131I-CD133mAb组移植瘤大部分肿瘤细胞坏死，细胞溶解，呈玻璃样变。　　实验结论:在BALB/c裸鼠体内131I-CD133mAb能特异性抑制CD133+Huh-7细胞的生长，发挥特异性靶向作用。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

摘要

前言

第一部分 分离、鉴定CD133+肝癌干细胞

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 131I-CD133mAb的制备与鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 131I-CD133mAb在体外对CD133+人肝癌干细胞生长抑制作用的研究

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第四部分 131I-CD133mAb在体内对荷人肝癌干细胞裸鼠模型的抑制作用的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

参考文献

全文总结

文献综述 放射免疫治疗在恶性肿瘤中的研究进展

致谢

硕士期间发表的论文