Agrin/MuSK信号通路在脓毒症致大鼠骨骼肌烟碱型乙酰胆碱受体异化重构中的作用

摘要

目的：研究脓毒症情况下大鼠产生骨骼肌功能障碍，以及神经肌肉接头（neuromuscular junction, NMJ）突触后膜上烟碱型乙酰胆碱受体（nicotinic acetylcholine receptor, nAChR）产生异化重构现象的机制，验证聚集蛋白 agrin 通过影响 agrin/MuSK （ muscle-specific kinase, MuSK）信号通路改善乙酰胆碱受体异化重构的现象并减轻神经肌肉功能障碍。　　方法：　　选取2-3月龄健康成年雄性Sprague-Dawley （ SD ）大鼠，体重250-280g。采用随机数字表法将大鼠分为3组，每组各12只大鼠，即对照组（Control组），假手术组（Sham组）和脓毒症组（CLP组）。脓毒症组采用盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture, CLP）术建立脓毒症模型，假手术组仅暴露腹腔并探查后逐层缝合，建模后24 h进行相应检测以及取材。采用ELISA法检测大鼠血浆中白细胞介素-6 （interleukin-6, IL-6）和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）水平来反映体内炎症状态；采用复合肌肉动作电位（compound muscle action potential, CMAP）衡量神经肌肉功能，测量其振幅、持续时间、潜伏期以及神经肌肉传导速度；通过免疫荧光法观测γ-nAChR和α7-nAChR在大鼠胫前肌表面分布情况；采用qRT-PCR检测大鼠胫前肌内烟碱型乙酰胆碱受体γ亚基和α7亚基的转录水平；采用western blot法测定大鼠胫前肌中agrin、MuSK、rapsyn、γ-nAChR、α7-nAChR和ε-nAChR的蛋白表达量。另取相同月龄及体重的SD大鼠24只，建立脓毒症模型后分为2组，即生理盐水组（CLP+S）和agrin组（CLP+A）。在建模后立即给予0.1 ml agrin蛋白溶液（100μg/ml）双侧胫前肌内注射，生理盐水组则注射等体积的生理盐水。两组在建模24 h后采用与第一部分相同的方法进行检测相同指标。　　结果：　　第一部分　　（1）大鼠血浆中炎症因子的比较：与Control组和Sham组相比， CLP组IL-6和TNF-α的表达水平明显提升，其差异有统计学意义（P＜0.05）。　　（2）CMAP相关检测指标的比较：与Control组和Sham组相比， CLP组大鼠CMAP振幅和神经传导速度减低，而其持续时间和潜伏期增长，差异有统计学意义（P＜0.05）。　　（3）免疫荧光法检测大鼠胫前肌γ-nAChR和α7-nAChR的分布表达：与Control组和Sham组相比，CLP组大鼠胫前肌组织中γ-nAChR和α7-nAChR的荧光表达显著增强，分布增加。　　（4）γ亚基和α7亚基转录水平的比较：与Control组和Sham组相比，CLP组大鼠胫前肌组织中Chrng和Chrna7基因的转录水平显著提升，差异有统计学意义（P＜0.05）。　　（5）各项蛋白表达情况的比较：与Control组和Sham组相比， CLP组大鼠胫前肌组织中γ-nAChR、α7-nAChR和ε-nAChR的蛋白表达量均表现出不同程度的增加， agrin的蛋白表达量减低， MuSK和rapsyn表达量增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。　　第二部分　　（1）大鼠血浆中炎症因子的比较：与生理盐水组相比，CLP+A组IL-6和TNF-α的表达水平没有显著变化，两者的差异没有统计学意义（P＞0.05）。　　（2）CMAP相关检测指标的比较：与生理盐水组相比，CLP+A组大鼠CMAP振幅和神经传导速度增加，而其持续时间和潜伏期缩短，差异有统计学意义（P＜0.05）。　　（3）免疫荧光法检测大鼠胫前肌γ-nAChR和α7-nAChR的分布表达：与生理盐水组相比，CLP+A组大鼠胫前肌组织中γ-nAChR和α7-nAChR的荧光表达降低，分布减少。　　（4）γ亚基和α7亚基转录水平的比较：与生理盐水组相比，CLP+A组大鼠胫前肌组织中Chrng和Chrna7基因的转录水平降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。　　（5）各项蛋白表达情况的比较：与生理盐水组相比，CLP+A组大鼠胫前肌组织中γ-nAChR、α7-nAChR和ε-nAChR的蛋白表达量降低，agrin的蛋白含量上升，MuSK和rapsyn表达量下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。　　结论：　　（1）脓毒症情况下大鼠骨骼肌异常的agrin/MuSK信号通路改变，可能与神经肌肉功能障碍以及烟碱型乙酰胆碱受体异化重构有关。　　（2）给予大鼠神经源性agrin可以通过调节其相关信号通路减少骨骼肌异质化乙酰胆碱受体的表达及相关亚基的转录，并减轻神经肌肉功能障碍。

目录

声明

英汉缩略词对照

前言

第一部分 脓毒症对大鼠骨骼肌agrin/MuSK信号通路和神经肌肉功能的影响

1 材料与方法

1.1 实验材料与动物

1.2 实验方法

1.3 统计学分析

1.4 统计学分析

2 实验结果

2.1 CLP模型的建立造成大鼠骨骼肌神经肌肉功能障碍

2.2 CLP诱导的急性脓毒症导致大鼠骨骼肌中nAChRs和agrin/MuSK信号通路的异常表达

3 讨论

第二部分 肌肉注射agrin减轻脓毒症引起的nAChR异化重构和骨骼肌功能障碍

1 材料与方法

1.1材料与方法

1.2实验方法

1.3统计学分析

2 实验结果

2.1外源性agrin改善脓毒症导致的大鼠骨骼肌神经肌肉功能障碍

2.2 外源性agrin改善大鼠骨骼肌中nAChRs和agrin/MuSK信号通路的异常表达

3 讨论

全文总结

1 结论

2 下一步研究方向

参考文献

文献综述:聚集蛋白在神经肌肉接头和肿瘤中的研究进展

致谢

攻读硕士学位期间的研究成果及发表论文