丹参酮ⅡA诱导口腔鳞癌细胞自噬的抗癌作用及分子机制研究

摘要

口腔鳞状细胞癌（Oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔内最常见的原发肿瘤。目前口腔癌的主要治疗手段包括手术和放射治疗，但传统的治疗方式存在不足，并且相当大比例的口腔癌患者可能发生转移和复发。为了提高口腔鳞状细胞癌的治疗效率，大量的研究关注于探索新的药物治疗靶点。自噬过程被认为是其中可能的靶点之一。　　自噬(autophagy)是一种广泛存在于真核生物细胞内的物质降解途径，对维持细胞内稳态和细胞器更新都有着重大的意义。在肿瘤的发生发展过程中，自噬活动贯穿全程。自噬维持稳态，对抗压力的属性也使它同时具有抑制肿瘤和促进肿瘤的双重属性。　　天然抗肿瘤的一些小分子化合物在化疗药物中占有重要地位。目前从天然药物中寻找新的抗肿瘤药物已经成为研究热点。丹参，为唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bge的干燥根和根茎。丹参酮ⅡA是从丹参中提取分离得到的二萜醌类化合物，被认为是丹参的主要有效成分。继往文献报道丹参酮ⅡA具有广谱抗肿瘤活性，还能通过诱导自噬使口腔鳞癌细胞对放射治疗敏化。据此我们推测丹参酮ⅡA可能通过调控自噬对口腔鳞癌细胞同样具有抗肿瘤作用。　　在本研究中，我们主要关注丹参酮ⅡA是否对口腔鳞癌细胞具有抑制作用，丹参酮 ⅡA能否诱导口腔鳞癌细胞自噬，丹参酮 ⅡA 诱导鳞癌自噬的分子机制是什么以及丹参酮 ⅡA 对口腔鳞癌细胞的抑制作用和自噬的关系，以此探讨丹参酮 ⅡA 对口腔鳞癌潜在的治疗价值以及自噬过程在口腔鳞癌的治疗中可能发挥的作用。　　本课题采用人口腔鳞癌细胞系SCC-9和敲低beclin1表达的SCC-9细胞系用于体外实验，OSCC 荷瘤裸鼠模型用于体内实验研究。用不同浓度的丹参酮ⅡA处理SCC-9细胞后，通过CCK8实验检测丹参酮ⅡA对SCC-9细胞增殖的抑制作用，流式细胞仪检测 SCC-9细胞的凋亡水平，透射电子显微镜检测和免疫荧光实验检测SCC-9细胞的自噬水平，并通过western blotting实验测定BECLIN1，ATG7，ATG12-ATG5，PI3K， AKT，mTOR C1等蛋白的表达水平。在后续实验中，用将细胞分为A空白组：加入新鲜培养液；B TAN组：调节培养液丹参酮ⅡA浓度为18μM；C siBECLIN1组：使用敲低beclin1基因表达的SCC-9细胞进行实验，余同空白组；D TAN+siBECLIN1组：使用敲低beclin1基因表达的SCC-9细胞进行实验，调节培养液丹参酮ⅡA浓度为18μM；E CQ组：培养液中加入自噬抑制剂氯喹。检测各组细胞的凋亡水平，自噬水平及自噬相关蛋白的表达水平。在体内实验中，雄性 BALB/c-nu 小鼠被随机分为三个实验组，空白组：裸鼠皮下注射 SCC-9 细胞荷瘤；TAN组：裸鼠皮下注射SCC-9细胞后，注射区域局部注射丹参酮ⅡA；si BECLIN1+TAN：采用敲低beclin1基因表达的SCC-9细胞，配合TAN组的成瘤操作方法进行荷瘤；小鼠四周后麻醉处死，通过定期记录瘤体体积描绘肿瘤生长曲线；通过HE染色观察肿瘤细胞结构；通过免疫组化染色和western blotting检测自噬相关蛋白表达水平。　　体外细胞实验证实了丹参酮ⅡA对SCC-9细胞增殖的抑制作用，丹参酮ⅡA诱导SCC-9细胞发生caspase-3依赖的凋亡。同时发现丹参酮ⅡA通过对BECLIN1/ATG7/ATG12-ATG5的诱导作用和对PI3K/AKT/mTOR的抑制作用共同促进了SCC-9细胞自噬。丹参酮ⅡA对SCC-9细胞的自噬诱导作用主要依赖于 BECLIN1的活性，自噬促进丹参酮 ⅡA 抑瘤作用。OSCC 荷瘤裸鼠模型上的结果进一步验证了体外细胞实验结果。给予丹参酮ⅡA可抑制BALB/c-nu小鼠SCC-9肿瘤的生长速度，敲低BECLIN1 的 SCC-9 肿瘤可以抵抗丹参酮 ⅡA 的抑瘤作用；给予丹参酮ⅡA 可以诱导 SCC-9 肿瘤发生自噬；同样处理条件下敲低 BECLIN1 的SCC-9肿瘤自噬水平较SCC-9肿瘤降低。　　根据结果我们推断丹参酮ⅡA对OSCC细胞的抑制作用基于部分依赖于BECLIN1的作用机制：beclin1基因的敲低阻断了丹参酮ⅡA在体内和体外对SCC-9 细胞的作用。本研究初步解释了丹参酮 ⅡA的作用机理：通过诱导BECLIN1/ATG7/ATG12-ATG5通路和抑制PI3K/AKT/mTOR通路共同诱导OSCC的细胞自噬，从而抑制了肿瘤的生长。本研究证实了丹参酮ⅡA对OSCC细胞的抗肿瘤作用，提示对自噬的调控有可能成为治疗OSCC的新的靶点。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一章 丹参酮ⅡA对人鳞癌细胞系SCC-9的抑制作用研究

1.1引言

1.2材料与方法

1.2.1实验试剂

1.2.2实验仪器

1.2.3溶液配制

1.2.4人鳞癌细胞系SCC-9细胞复苏

1.2.5人鳞癌细胞系SCC-9细胞传代培养

1.2.6 CCK8法检测不同浓度丹参酮ⅡA对人鳞癌细胞系SCC-9的抑制作用

1.2.8不同浓度丹参酮ⅡA诱导人鳞癌细胞系SCC-9凋亡效能检测

1.2.9 Western blotting检测凋亡相关蛋白表达水平

1.2.10统计学分析

1.3实验结果

1.3.2不同浓度丹参酮ⅡA不同作用时间对人鳞癌细胞系SCC-9增殖的抑制作用

1.3.3不同浓度丹参酮ⅡA对人鳞癌细胞系SCC-9凋亡的影响

1.3.4 Western blotting检测凋亡相关蛋白表达水平

1.4讨论

1.5本章小结

第二章 丹参酮ⅡA诱导人鳞癌细胞系SCC-9自噬的研究

1.1引言

1.2材料与方法

1.2.1实验试剂

1.2.2实验仪器

1.2.3透射电镜检验自噬

1.2.4免疫荧光实验检测自噬

1.2.5 Western blotting检测自噬相关蛋白表达水平

1.2.6统计学分析

1.3实验结果

1.3.1透射电镜检测结果

1.3.2免疫荧光实验结果

1.3.3 Western blotting结果

1.4讨论

1.5本章小结

第三章 BECLIN1对丹参酮ⅡA诱导人鳞癌细胞系SCC-9自噬的作用研究

1.6引言

1.7材料与方法

1.7.1实验试剂

1.7.2实验仪器

1.7.3敲低beclin1基因表达的SCC-9细胞系的构建

1.7.4丹参酮ⅡA诱导人鳞癌细胞系SCC-9凋亡效能检测

1.7.5透射电镜检验自噬

1.7.6免疫荧光实验检测自噬

1.7.7 Western blotting检测自噬相关蛋白表达水平

1.7.8统计学分析

1.8实验结果

1.8.1丹参酮ⅡA诱导人鳞癌细胞系SCC-9凋亡效能检测

1.8.2透射电镜检验结果

1.8.3免疫荧光检测结果

1.8.4 Western blotting检测结果

1.9讨论

1.10本章小结

第四章 人鳞癌细胞系SCC-9荷瘤裸鼠模型的建立及自噬对丹参酮ⅡA抑瘤作用的影响研究

1.11引言

1.12材料与方法

1.12.1实验试剂

1.12.2实验仪器

1.12.3动物实验设计及实验动物模型建立

1.12.4裸鼠注射植瘤

1.12.5组织石蜡包埋切片

1.12.6 HE染色

1.12.7免疫组化染色

1.12.8 Western blotting检测自噬相关蛋白表达水平

1.12.9统计学分析

1.13实验结果

1.3.1术后观察

1.3.2瘤体测量结果

1.3.3组织学分析

1.3.4 Western blotting检测结果

1.14讨论

1.15本章小结

全文总结

博士期间发表论文及参与科研情况

参考文献

综述:天然小分子诱导肿瘤自噬研究进展

致谢