经验性抗生素使用对早产儿肠道菌群与代谢产物的影响及维生素A在新生儿坏死性小肠结肠炎中的作用研究

摘要

第一部分早产儿生后经验性抗生素使用对早期肠道菌群及代谢产物的影响　　目的：新生儿时期是肠道菌群稳态建立的关键时期，为了控制早发败血症，有感染高危风险的早产儿常常在生后立即经验性使用抗生素，而抗生素对肠道菌群组成有显著的影响。本研究旨在明确生后一周抗生素的使用对早产儿肠道菌群及其代谢产物的影响，为临床抗生素的合理使用提供理论依据。　　方法：研究对象为出生后立即送往重庆医科大学附属儿童医院住院治疗的早产儿。依据抗生素使用情况分为两组，一组为哌拉西林他唑巴坦钠组（Piperacillin/tazobactam, Pt组），另一组为联用青霉素与拉氧头孢组（ Penicillin+Latamoxef, PL组），对照组为未用抗生素组（Antibiotic-free, AF组）。分别收集三组患儿第3天（Day3）和第7天（Day7）的粪便标本，基于16S rDNA高通量测序的方法分析各组患儿肠道菌群组成情况，采用液相色谱-质谱联用平台对三组患儿肠道代谢产物进行分析。　　结果：与日龄第3天相比，哌拉西林他唑巴坦钠（Pt）组与青霉素拉氧头孢联用（PL）组第7天的物种多样性指数Shannon index降低（Pt组P＜0.05，PL组P<0.01），而未用抗生素（AF）组第3天和第7天的Shannon指数差异无统计学意义（ P＞0.05）；偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）结果表明在日龄第3天和第7天抗生素组组内标本个体差异均较对照组大；菌群组成分析结果显示，在门水平，日龄第3天三组间有统计学差异的菌群为拟杆菌门（P<0.001）和放线菌门(P＜0.05)，当抗生素连续使用7天后，三组间有统计学差异的菌群为变形菌门（ P＜0.05）、厚壁菌门（ P＜0.05）、拟杆菌门（ P<0.001）、放线菌门（P<0.01），将各组自身第3天和第7天的菌门比例变化进行比较发现，仅Pt组的放线菌门和PL组的拟杆菌门变化差异有统计学意义，Pt组的放线菌门比例在第7天较第3天降低（P<0.01），而PL组的拟杆菌门比例第7天较第3天增加（P<0.01）；在属水平，假单胞菌属（占Pt组23.73%为三组中最高, P＜0.05），肠球菌属（占Pt组23.26%为三组中最高, P<0.01），乳杆菌属（占PL组28.04%为三组中最高, P<0.001），鞘氨醇单胞菌属（占PL组6.64%为三组中最高, P<0.001）在三组间的差异有统计学意义，在第7天三组间有统计学差异的菌属为克雷伯菌属（占AF组64.39%为三组中最高, P＜0.05），肠球菌属（占Pt组48.12%为三组中最高, P<0.001），埃希-志贺菌属（占PL组17.25%为三组中最高, P＜0.05），狭义梭菌属（占AF组5.62%为三组中最高, P<0.01），Peptoclostridium菌属（占AF组5.60%为三组中最高, P<0.001），假单胞菌属（占 PL组2.688%为三组中最高,P<0.01），比较各组自身第3天和第7天的菌属比例发现，Pt组中肠球菌在抗生素使用7天后比例升高（P＜0.05），而埃希-志贺菌属（P＜0.05）、假单胞菌属及不动杆菌属（P均<0.001）比例降低，PL组中差异有统计学意义的菌属为乳杆菌属（P<0.01）、鞘氨醇单胞菌属及不动杆菌属（P均<0.05），均在第7天比例下降，而AF组中克雷伯菌属在第7天比例显著升高（P＜0.05），不动杆菌属（P<0.001）及埃希-志贺菌属（P＜0.05）比例降低；分析代谢组学结果发现第3天三组间有差异的代谢产物为丝氨酸、缬氨酸、丙三醇、葡萄糖酸（P均<0.05）及脯氨酸（P<0.01），第7天有6种代谢产物有统计学差异，具体为柠檬酸、缬氨酸（P均<0.001）、亚油酸、谷氨酸（P均<0.01）、以及酪氨酸和泛酸（P均<0.05）；差异代谢通路分析显示第3天时三组间仅有7条代谢通路有显著差异（P均<0.05），其中 Pt组与PL组代谢通路的活性完全相反，在第7天则有22条代谢通路出现了明显差异（P均<0.05），其中PL组与AF组的代谢通路活性完全相反；PLS-DA分析显示随抗生素使用时间延长抗生素组肠道代谢产物的构成与未用抗生素组差异增大，且在不同的抗生素种类作用下代谢产物的构成也明显不同；菌群与代谢产物的关联分析发现亚油酸、谷氨酸、缬氨酸、泛酸等人体重要的代谢产物在AF组都显著增加，且与该组中菌群丰度丰富的韦荣球菌属，柠檬酸杆菌属及Peptoclostridium菌属密切相关，但与两抗生素组中丰度高的菌群呈明显的负相关，特别是青霉素拉氧头孢联用组。　　结论：抗生素对早产儿生后一周肠道菌群的定植及代谢产物产生了显著的影响。随抗生素使用时间延长，抗生素组致病菌的比例明显增多，如埃希-志贺菌属及肠球菌属。此外无论抗生素的种类，7天时抗生素组菌群的多样性较第3天显著下降。而肠道代谢产物及相关代谢通路的变化趋势也与高通量测序分析结果一致，随抗生素使用时间延长组间差异代谢产物和差异代谢通路都增加，每组中高表达的代谢产物多数与该组高丰度的菌群呈正相关，抗生素组正常代谢产物表达减少，重要代谢通路活性降低，而青霉素与拉氧头孢联用对肠道菌群与代谢产物的影响明显大于哌拉西林他唑巴坦钠。　　第二部分维生素A在新生儿坏死性小肠结肠炎中的作用研究　　目的：新生儿坏死性小肠结肠炎（Neonatal necrotizing enterocolitis, NEC）是发生在新生儿尤其是早产儿的严重肠道急症。目前普遍认为NEC是由于病原菌入侵发育未成熟的肠上皮而引起的过度炎症反应。而维生素A（VA）是正常生理代谢必需的营养物质，在上皮生长、机体免疫调节等方面有重要的作用。故本研究拟通过检测NEC发生时患儿肠道菌群及维生素A水平的变化情况，明确VA、菌群、NEC之间的相关性，再以补充VA为干预手段，研究其在NEC发生发展中的重要作用，为临床治疗提供新的思路。　　方法：临床标本收集及处理：收集重庆医科大学附属儿童医院NEC手术患儿及对照肠闭锁、肠狭窄患儿的血清及肠灌洗液标本。采用高效液相色谱法（HPLC）检测两组患儿血清维生素 A水平，基于16S rDNA高通量测序方法分析两组患儿肠道菌群组成情况。　　体内试验：用VA（VAS组）及磷酸盐缓冲液（PBS组）分别灌胃新生小鼠7天后进行 NEC建模，采用 HPLC方法检测两组小鼠血清VA水平，采用HE染色、NEC病理评分比较两组小鼠肠组织病理损伤情况；采用16S rDNA高通量测序的方法分析两组新生鼠肠道菌群的组成情况；采用qPCR及ELISA检测炎症因子水平；采用蛋白质印迹法（WB）比较两组肠道紧密连接蛋白的表达情况。　　体外试验：采用视黄酸（RA）干预人克隆结肠腺癌细胞（Caco-2 cell）形成的单层肠上皮细胞屏障模型，测定跨上皮电阻TEER值分析单层肠上皮细胞的完整性；采用qPCR及ELISA分析RA干预后Caco-2细胞分泌炎症因子水平；采用WB分析RA干预后肠道紧密连接蛋白表达情况。　　结果：临床标本：NEC组患儿血清 VA水平明显低于对照组（P＜0.05），肠道变形菌门比例较对照组升高（P＜0.05），拟杆菌门比例降低（P<0.01）。　　体内实验：VAS组的VA水平明显高于PBS组（P<0.01），门水平变形菌门比例较 PBS组降低（P＜0.05），拟杆菌门增高（P<0.01），属水平埃希-志贺菌属降低（P＜0.05）、拟杆菌属增高（P<0.01）；qPCR及ELISA结果显示炎症因子IL-6、TNF-α表达下降（mRNA水平IL-6：P＜0.05，TNF-α：P<0.01；蛋白水平IL-6：P<0.001，TNF-α：P＜0.05）， NEC组织病理学评分VAS组低于PBS组（P＜0.05），肠组织损伤减轻，肠道紧密连接蛋白Claudin-1, Occludin（P均<0.05）及ZO-1（P<0.01）表达水平增高。　　体外实验：不同浓度 RA干预后 Caco-2细胞 TEER明显增加（P均<0.01），能降低LPS对细胞的损伤；炎症因子IL-6、IL-8表达均降低（mRNA水平IL-6:P均<0.001，IL-8:5R-10L组P<0.0001,2R-10L组P<0.001；蛋白水平5R-10L组IL-6与IL-8：P均<0.01，2R-10L组IL-6与IL-8：P均<0.05）；5R-10L组肠道紧密连接蛋白Occludin（P＜0.05）、Claudin-1及ZO-1（P均<0.01）在RA干预后表达升高，而2R-10L组仅Claudin-1在RA干预后表达升高（P＜0.05），其余两种蛋白表达与对照组无统计学差异（P＞0.05）。　　结论：NEC发病的部分机制可能为NEC患儿VA水平低，肠上皮细胞屏障发育不完善，变形菌门增加，拟杆菌门降低，肠道菌群稳态发生紊乱，最终导致肠道屏障破坏，致病菌侵入肠粘膜引起过度炎症反应。补充VA可降低变形菌门比例、增加拟杆菌门比例，下调炎症因子IL-6、IL-8、TNF-α水平，还可增强肠紧密连接蛋白的表达、提高肠上皮完整性，VA在NEC的发生发展中发挥了重要的保护作用。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分 早产儿生后经验性抗生素使用对早期肠道菌群与代谢产物的影响

1研究对象与方法

2结果

3讨论

4结论

第二部分 维生素A在新生儿坏死性小肠结肠炎中的作用研究

第一节 新生儿坏死性小肠结肠炎患儿肠道菌群组成及维生素A水平研究

第二节 维生素A在新生儿坏死性小肠结肠炎中的调节作用研究

全文总结

参考文献

文献综述:生命早期微生物的定植对免疫系统的影响

致谢

攻读博士学位期间发表的论著