齐墩果酸抑制HMGB1-TLR4-中性粒细胞正反馈环减轻小鼠肝缺血再灌注损伤

摘要

目的：　　探讨齐墩果酸（ oleanolic acid， OA）对小鼠肝缺血（ ischemia-reperfusion，IR）再灌注损伤的保护作用及其机制。　　方法：　　将Balb/c雄性小鼠随机分为4组：假手术对照组（Control组）、齐墩果酸对照组（OA组）、肝缺血再灌注模型组（IR组）和齐墩果酸干预组（OA+IR组）。肝缺血再灌注模型组（IR组）干预方式：小鼠麻醉好后，沿着腹白线剖开，暴露门脉三联管（小叶间动脉、小叶间静脉和小叶间胆管）用无创小号血管夹将其夹闭，使70％的肝脏缺血3 h再灌注6 h。齐墩果酸的给药剂量为100 mg/kg，给药方式为灌胃3次，每次间隔8 h（最后一次灌胃在术前半小时）。小鼠肝脏再灌注6 h后获得血清，检测其丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸转氨酶（aspartate transaminase，AST）活性水平；取缺血再灌注肝叶（中叶或者左叶）做石蜡切片后再用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，观察肝脏组织病理变化；原位末端转移酶标记技术TUNEL（ transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick end labeling）和蛋白印记法（Western blot）检测有关调控凋亡的信号分子Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3、cleaved caspase-7和cleaved caspase-9评价肝脏组织的坏死程度和细胞凋亡情况。免疫组织化学（ immunohistochemistry， IHC）定性检测高迁移率族蛋白B1（ high mobility group box-1 protein，HMGB1）的表达情况；实时定量逆转录PCR（quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR）检测toll样受体4（ toll like receptor4， TLR4）、肿瘤坏死因子-?（ tumor necrosis factor-alpha，TNF-?）和白细胞介素-1?（interleukin-1beta，IL-1?）mRNA的表达；酶联免疫吸附试验（ enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）检测血清中TNF-??和IL-1?的表达；Western blot分析肝脏组织中磷酸化的丝裂原活化蛋白酶（ mitogen-activated protein kinases， MAPKs)：磷酸化的细胞外调节蛋白激酶（phosphorylated extracellular signal-regulated kinase， p-ERK）、磷酸化的 p-c-Jun氨基末端激酶（ phosphorylated c-Jun N-terminal kinase， p-JNK）和磷酸化的 p-38（p-p38）蛋白水平的变化；流式细胞术（flow cytometry，FCM）分析中性粒细胞募集程度。　　结果：　　OA+IR组与IR组相比，OA预处理后，血清中ALT和AST的活性水平显著降低，肝脏组织病理损伤程度减小以及凋亡细胞明显减少，由核内释放到细胞外的HMGB1极大地减少，TLR4和磷酸化的MAPKs蛋白表达水平均明显下调，TNF-?和IL-1?的mRNA和蛋白表达水平显著降低，中性粒细胞的募集极大地减少。　　结论：　　齐墩果酸对小鼠肝缺血再灌注诱导的损伤具有保护作用。其保护作用机制可能与抑制HMGB1-TLR4-中性粒细胞正反馈环从而阻断了炎症级联反应有关。

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前言

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果

2.1 OA对小鼠肝缺血再灌注损伤血清转氨酶（ALT/AST）活性水平和肝脏组织损伤情况的影响

2.2 OA对肝缺血再灌注损伤中细胞的凋亡的影响

2.3 OA对小鼠肝缺血再灌注诱导的肝损伤中HMGB1、TLR4、p-ERK、p-JNK、p-P38蛋白表达水平的影响

2.4 OA对炎症因子TNF-?和IL-1?的转录和释放的影响

2.5 OA对小鼠肝缺血再灌注诱导的肝损伤中中性粒细胞募集的影响

3 讨论

4 结论

参考文献

文献综述:齐墩果酸在肝脏疾病当中的研究进展

致谢

硕士期间发表的论文