远志皂苷对Aβ1-40诱导大鼠脑神经元凋亡及tau蛋白异常过度磷酸化的保护作用及其机制的研究

摘要

目的:
　　 阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)又称老年性痴呆，是一种多发生在老年阶段的神经退行性疾病，其主要病理特征为老年斑(Senile plaque，SP)、神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangles，NFTs)及神经元丢失现象等。研究发现NFTs的主要成分是过度磷酸化的tau蛋白。Tau蛋白是一种微管相关蛋白，其主要生理功能是促进微管组装和维持微管稳定，而过度磷酸化的tau蛋白则丧失其生理功能，导致微管解聚，聚集形成NFTs，进而导致神经元退行，丧失其功能。目前随着人口老龄化程度加剧，阿尔茨海默病的发病率也呈逐年增高趋势。因此研究AD的发病机制及寻找有效治疗药物已成为当前的研究热点之一。本实验通过大鼠脑内注射Aβ1-40建立AD大鼠模型，研究远志皂苷对AD大鼠脑神经细胞凋亡的保护作用以及对Aβ1-40造成的tau蛋白过度磷酸化的抑制作用及其机制。
　　 方法:
　　 取SD大鼠50只，随机分为假手术对照组、模型组、TEN低、中、高3个剂量组，每组10只。实验采用大鼠右侧海马CA1区注射Aβ1-40建立AD大鼠模型，模型建立成功后用远志皂苷连续灌胃，治疗时间为30天。治疗结束后，采用HE染色、尼氏体染色和透射电镜技术观察远志皂苷对Aβ1-40造成的神经元损伤的保护作用;蛋白免疫印记(Western blot)法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cyt-C的蛋白表达水平;免疫组织化学染色法观察脑组织中tau蛋白磷酸化相关激酶PKA、PP-2A;总tau蛋白及tau(p-Ser396)表达分布情况;蛋白免疫印记(Western blot)法检测PKA、PP-2A、总tau蛋白、tau(p-Ser396)的表达水平。
　　 结果:
　　 1.远志皂苷对Aβ1-40造成的神经元损伤的保护作用
　　 与正常组相比，模型组神经元排列疏松，胞体呈现不规则形状，细胞膜破损严重，轴突退化，突触结构有不同程度的破坏，数目减少，突触前膜附近的突触囊泡密度明显变小，突触后膜致密物质厚度明显变窄。远志皂苷干预治疗后，较模型组相比，治疗组神经元数量增多，胞体完整，排列较精密，细胞膜破损情况明显好转，轴突退化现象有所改善，突触结构清晰、完整，数目增多，突触前膜附近的突触囊泡密度变大，突触后膜致密物质厚度明显增加。
　　 2.远志皂苷对AD大鼠脑神经细胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cyt-C表达的影响
　　 Western blot法检测发现，与正常组相比，模型组Bax、Caspase-3、Cyt-C蛋白含量明显增加;模型组Bcl-2蛋白含量明显减少。远志皂苷干预治疗后，治疗组Bax、Caspase-3、Cyt-C蛋白含量较模型组有明显减少;治疗组Bcl-2蛋白含量较模型组有明显增加。
　　 3.远志皂苷对AD大鼠脑神经细胞tau蛋白磷酸化相关激酶PKA、PP-2A的调节作用及总tau蛋白、tau(p-Ser396)表达的影响
　　 免疫组织化学染色观察，与正常组相比，模型组PKA阳性表达细胞数明显增加;模型组PP-2A阳性表达细胞数明显减少;模型组总tau蛋白、tau(p-Ser396)阳性表达细胞数有明显增加。远志皂苷干预治疗后，治疗组PKA阳性表达细胞数较模型组有明显减少;治疗组PP-2A阳性表达细胞数较模型组有明显增加;治疗组总tau蛋白、tau(p-Ser396)阳性表达细胞数较模型组有明显减少。Western blot定量分析，进一步证实免疫组化结果，与正常组相比，模型组PKA蛋白表达量明显增加;PP-2A蛋白表达量明显减少;总tau蛋白、tau(p-Ser396)蛋白表达量明显增加。远志皂苷干预治疗后，治疗组PKA蛋白表达量较模型组有明显减少;PP-2A蛋白表达量较模型组有明显增加;总tau蛋白、tau(p-Ser396)蛋白表达量较模型组有明显减少。
　　 结论:
　　 根据以上结果，本实验得出以下结论:
　　 1.大鼠海马CA1区注射Aβ1-40对大鼠会造成神经毒性和神经元损伤，而远志皂苷对Aβ1-40造成的神经毒性和神经元损伤有明显的改善作用，可以保护神经细胞不受Aβ1-40的毒害作用。
　　 2.远志皂苷可能是通过抑制Bax的表达，促进Bcl-2的表达来防止Cyt-C向细胞质渗漏，从而抑制Caspase级联反应的激活，以达到保护神经细胞，抑制凋亡发生的作用。
　　 3.远志皂苷可能是通过解除Aβ1-40造成的对蛋白磷酸酯酶PP-2A的抑制作用，降低蛋白激酶PKA的表达，从而达到降低脑神经元总tau蛋白表达量，恢复tau蛋白磷酸化正常水平的作用。

目录

声明

摘要

英文缩略词表

前言

第一部分 远志皂苷对Aβ1-40诱导的大脑神经细胞病理形态的影响

1 材料

1．1 动物

1．2 试剂和药品

1．3 主要仪器

2 方法

2．1 动物分组

2．2 动物模型建立方法

2．3 给药方法

2．4 取材及样本制备

2．5 HE染色

2．6 尼氏体染色

2．7 透射电镜观察

3 结果与分析

3．1 远志皂苷对Aβ1-40诱导的大鼠海马神经元细胞形态的影响

3．2 远志皂苷对Aβ1-40诱导的大鼠海马神经元细胞损伤的影响

3．3 远志皂苷对Aβ1-40诱导的大鼠海马神经元突触结构的影响

4 讨论

第二部分 远志皂苷对AD大鼠脑神经细胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cyt-C 表达的影响

1 材料

1．1 动物

1．2 试剂和药品

1．3 主要仪器

2 方法

2．1 主要试剂的配制

2．2 动物分组

2．3 动物模型建立方法

2．4 给药方法

2．5 取材及样本制备

2．6 蛋白免疫印记(Western blot)

2．7 统计学分析

3 结果与分析

3．1 远志皂苷对AD大鼠脑神经元Bax蛋白含量的影响

3．2 远志皂苷对AD大鼠脑神经元Bcl-2蛋白含量的影响

3．3 远志皂苷对AD大鼠脑神经元Cyt-C含量的影响

3．4 远志皂苷对AD大鼠脑神经元Caspase-3蛋白含量的影响

4 讨论

第三部分 远志皂苷对AD大鼠脑神经细胞tau蛋白磷酸化相关激酶PKA、PP-2A的调节作用及总tau蛋白、tau(p-Ser396)表达的影响

1 材料

1．1 动物

1．2 试剂和药品

1．3 主要仪器

2 方法

2．1 动物分组

2．2 动物模型建立方法

2．3 给药方法

2．4 取材及样本制备

2．5 免疫组织化学染色

2．6 蛋白免疫印记(Western blot)

2．7 统计学分析

3 结果与分析

3．1 远志皂苷对AD大鼠脑神经细胞PKA表达的影响

3．2 远志皂苷对AD大鼠脑神经细胞PP-2A表达的影响

3．3 远志皂苷对AD大鼠脑神经细胞tau蛋白表达的影响

3．4 远志皂苷对AD大鼠脑神经细胞tau(p-Ser396)蛋白表达的影响

4 讨论

总结

参考文献

附图

个人简历

致谢