拟南芥氧化胁迫敏感突变体的筛选和基因定位

摘要

面对各种环境压力如干旱、低温、盐碱、重金属等，植物自身会有一套调节防御的机制，因此筛选一些抗逆基因，进而研究植物防御环境压力的机制具有十分重要的作用和意义。本论文共由四章组成：第一章综述了本实验的研究对象拟南芥的生物学特性和遗传学特性，以及所涉及的相关实验技术。第二章论述了拟南芥氧化胁迫敏感突变体的筛选和基因定位，共筛选到12株对H2O2敏感的突变体，并采用TAIL-PCR方法，成功对突变体H3，H9，H12，H14，H17，H18T-DNA插入位点的侧翼序列进行了扩增，同时利用三引物法，对T-DNA插入位点进行了验证，并在F3代中鉴定出了纯合体。第三章论述了拟南芥ICE1突变体的鉴定和植物表达载体的构建以及遗传转化。在成功的对ICE1突变体进行鉴定的基础上，克隆得到了ICE1基因及其promotor。此外我们还成功的构建了植物表达载体pEGAD-ICE1，pEGAD-PICE1：ICE1，并利用根癌农杆菌成功的将其转化到拟南芥中并获得了稳定遗传的转基因植株。第四章详细论述了拟南芥NAC1和SIP1双基因反义表达载体的构建及遗传转化。
　　 第一章文献综述
　　 十字花科植物拟南芥(Arabidopsisthaliana)是实验室常用的模式植物。随着拟南芥(A.thaliana)基因组测序的完成，公共数据库中已经积累了大量的序列信息，但大部分序列的功能尚不清楚。
　　 利用突变来研究基因的功能，是认识和了解生命活动规律的常用而有效的方法，突变体是功能基因组学研究的良好材料。
　　 第二章拟南芥氧化胁迫敏感突变体的筛选和基因定位
　　 活性氧(ActiveOxygenSpecies，AOS)是指氧的某些代谢中间产物及其衍生的含氧物质，具有较活泼的化学性质。活性氧的研究已成为逆境生物学研究领域的一个重大理论课题，而H2O2作为信号分子在植物细胞中转导的细节及其与胞内其它信号分子的时空关系还知之甚少。本实验筛选到12株对H2O2敏感的突变体(H3，H4，H6，H7，H8，H9，H13，H14，H17，H18，H61，H71)，并将F2代种子在含500μMH2O2的MS培养基上复筛，以确定其表型。并通过TAIL-PCR方法成功将T-DNA插入位点的侧翼序列扩增，测序结果经NCBI比对，其T-DNA插入基因分别为lipid-associatedfamily，auxinresponsefactor，SIRsulfitereductase，leucine-richrepeatproteinkinase，MLO8calmodulinbinding，diseaseresistanceprotein，利用三引物法，对T-DNA插入位点进行了验证，并在F3代中鉴定出了纯合体。
　　 第三章拟南芥ICE1突变体的鉴定和植物表达载体的构建及遗传转化
　　 ICE1作为冷响应靶基因的上游调控因子，低温下正调节低温诱导的反式作用因子CBF转录激活因子，使其与COR基因启动子区域中的CRT/DRE核心元件结合，提高COR元件的表达水平，从而使植物的抗寒性大大提高。本实验采用三引物法对ICE1T-DNA插入突变体进行鉴定得到纯合体，以得到的纯合体的cDNA为模板扩增得到ICE1基因及其promotor。此外我们还成功的构建了植物表达载体pEGAD-ICE1，pEGAD-PICE1：ICE1，并利用根癌农杆菌成功的将其转化到拟南芥中获得了稳定遗传的转基因植株。
　　 第四章拟南芥NAC1和SIP1双基因反义表达载体的构建及遗传转化
　　 本研究通过酵母双杂交技术筛选得到与SOS2蛋白互作的未知蛋白SIP1，并克隆得到SIP1基因，同时还克隆了能促进拟南芥侧根发育的NAC1基因。然后将SIP1基因和NAC1正义基因以及SIP1基因和NAC1反义基因分别整合到一个改造了的具有2个35S启动子的可用于双基因表达的RNA干扰载体pFGC5941中，并将构建的两个载体转化到野生型拟南芥中，共获得15株转基因植株。这些转基因苗为进一步研究SIP1和NAC1两基因的功能及对拟南芥盐胁迫下侧根发育的调控奠定了良好基础。