基于生物传感器的microRNA检测及其在法医学体液鉴定中的应用

摘要

研究背景：　　在法医学现场勘查中，对不同体液的正确收集和识别往往能暴露案件的性质，并有利于案件现场重建。目前已有的体液来源鉴定方法有：化学试验、免疫学试验，蛋白质催化活性试验，光谱学方法和显微观察。这些常规体液鉴定方法大多只能初筛而不能认定，存在低敏感度、特异性及易受腐败等因素影响的缺陷。近年来，基于分子遗传学的核酸分析方法，如体液特异性信使RNA（messenger RNA, mRNAs）、组织特异性差异性甲基化区域（tissue-specific differentially methylated regions, tDMRs）、microRNAs（miRNAs）的检测逐渐发展，取代传统的体液识别方法。　　其中，miRNA作为一类短（18-25nt）、内源性非编码的RNA小分子，已被证实在不同体液中的表达存在差异。因其序列短小，能耐受腐败降解影响，已有研究证实 miRNA能在唾液和血液斑迹中稳定存在，实验室条件下保存1年仍可稳定检出。MiRNA的这些特点使其可以作为法医学体液来源鉴定新的分子工具，其表达谱逐渐成为体液识别（如尿液、静脉血、月经血、羊水、精液、阴道分泌物等）的潜在实用平台。但是，miRNA有小片段、低丰度（占总RNA含量的0.01%）等特点，其定量分析给常规方法带来了挑战。目前已有的miRNA检测方法，如免疫印迹法、阵列分析及逆转录聚合酶链式反应（ reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR），又存在诸如低灵敏度、仪器依赖等缺陷。建立一种高效、快速、灵敏的miRNA检测方法对法医学微量物证的体液鉴定（来源及形成时间）尤为重要。近年来，生物传感器因其简单、快速、特异、经济、灵敏等特点，已成为多领域的检测分析工具，将生物传感策略与核酸检测相结合，能实现核酸的简单快速检测。　　同时，miRNA作为一种小分子RNA，理论上其不可避免的会受到RNA酶降解的影响，以往关于 miRNA稳定性的研究大多在冰冻条件下（-20℃~-80℃，液态）保存或制作成体液斑迹常温保存。而在法医实际检案中，生物检材往往在常温、自然条件下存在，有时甚至被人为用高温、冲洗等手段破坏，且生物检材的长期冷冻保存成本较高。因此，探讨不同保存条件对miRNA降解的影响可以为法医检案中涉及miRNA检测的样本保存条件提供依据，且 miRNA降解规律有望为体液形成时间推断提供理论数据。　　目的：　　基于生物传感策略，建立一种高效、快速、灵敏的miRNA检测方法，为法医学检材的体液来源鉴定提供新的检测平台；基于本研究建立的方法，探讨不同保存条件下体外样本miRNA含量的时序性规律，为法医检案中涉及 miRNA检测的样本保存条件提供依据，为体液斑（痕/迹）形成时间推断提供理论基础。　　方法：　　采用靶物质触发的三交联（three-way junction，3-WJ）结构提高特异性，采用等温指数扩增（exponential amplification reaction， EXPAR）技术联合“正反馈”的双重放大策略提高放大效率，建立一种简便、快速、高灵敏、高特异性的miRNA检测的电化学传感方法。基于新建立的 miRNA检测方法，探讨不同物质形态（干燥斑、溶液）、不同溶剂（DEPC水、人血清）及不同保存温度（4℃、25℃）条件下分别保存1天、3天、1周、2周、3周、4周后， miRNA含量的时序性规律。　　结果与讨论：　　本研究建立的电化学传感策略检测目标 miRNA的线性范围为1fM-1nM，最低检测限为0.14fM。在该线性范围内，传感信号值与目标 miRNA浓度的对数呈线性关系，其线性方程为：ip（μA）=1.97e-6+1.91e-6 lgCmiRNA（R2=0.9996）。通过靶物质触发的3-WJ结构设计，显著提高特异性，可识别单碱基错配的miRNA序列；特殊设计的“正反馈”区域可使信号放大至先前的1.5倍，实现目标miRNA的高特异性及超灵敏检测。目标miRNA在10%人血清中的回收实验显示，添加不同浓度的目标 miRNA至10%人血清，其回收率均介于95%-104%。在10例月经血样本中，仅有2例检测出微弱的DPV输出信号；通过反转录实时荧光定量PCR（ reverse transcription quantitative real-time PCR, RT-qPCR）检测，10例月经血样本中目标miRNA相对表达量介于0.313227至2.071213之间；其中检出DPV信号的2例月经血样本中目标miRNA相对表达量高。　　不同溶剂的miR-214制作成干燥斑后，不同保存温度条件下保存4周以内，miR-214含量无明显差异（p＞0.01）。利用DEPC水制作成的miR-214溶液在4℃条件下保存，其含量分别为初始含量的80%-90%（1天）、46%-54%（3天）、26%-32%（1周）、0.04%-0.06%（2周）；在25℃条件下保存，miR-214含量分别为初始含量的68%-71%（1天）、22%-25%（3天）、0.009%-0.16%（1周）。利用人血清制作成的miR-214溶液在4℃条件下保存，其含量分别为初始含量的70%-80%（1天）、35%-42%（3天）、0.07%-0.1%（1周）；在25℃条件下保存，miR-214含量分别为初始含量的38%-45%（1天）、18%-19%（3天）。溶液中miR-214含量随保存时间的延长呈单指数衰减（P＜0.01）。　　结论：　　本研究建立了一种基于靶物质触发的双重等温级联扩增电化学生物传感策略的方法，所建立的电化学传感方法可超灵敏、高特异性的检测miRNA，并具有良好的可重复性。　　尽管本研究所建立的方法在10例月经血真实样本中，仅有2例检出微弱的DPV输出信号，但回收实验表明该方法不受复杂样本的干扰。因此，该研究成果仍为法医学微量检材的体液来源鉴定提供新的检测思路。　　在干燥斑中保存4周以内，体外合成的miRNA含量不受溶剂、保存温度的影响。MiRNA制剂的干燥斑有望实现miRNA的长期保存。　　在溶液中，体外合成的miRNA含量随保存时间的延长逐渐降低，该降低趋势在25℃的血清溶液中表现尤为明显。MiRNA的时序性规律有望为潮湿环境下短期保存的样本的形成时间推断提供理论依据。

目录

声明

英汉缩略语名词对照

前言

第一部分 基于靶物质触发的双重等温指数扩增的电化学生物传感策略用于microRNA的超灵敏检测

1引言

2材料与方法

3结果与讨论

4小结

第二部分 不同物质形态、不同溶剂、不同温度条件下体外合成的microRNA含量的时序性规律研究

1引言

2材料与方法

3结果与讨论

4小结

全文总结

不足之处与展望

参考文献

文献综述:法医学体液识别的研究进展

致谢

攻读博士学位期间发表的学术论文