共代谢生物催化三氯乙烯降解工艺与机理研究

摘要

具有“致畸、致癌、致突变”效应的挥发性氯代烃三氯乙烯（Trichloroethene，TCE），是一种重要的有机溶剂和化工原料，但使用过程中的不当处置导致 TCE泄露和直接排放，严重污染了水体、土壤和大气环境。作为重要的 TCE人为源，生活垃圾填埋场在有机物降解过程也产生了大量的氯代烃污染物。生活垃圾填埋场在长期温室气体甲烷，二氧化碳和挥发性氯代烃的胁迫下产生了大量功能微生物，又因为污染源富集的混合菌群具有高耐受和互营养的生物特性，可通过共代谢、直接氧化等多种途径更有效的降解氯代烃污染物，被认为是去除 TCE等氯代烃类污染物的有效途径。据此，本文以明晰填埋场中功能微生物种群结构，实现高效甲烷减排及 TCE生物降解为目标，以垃圾填埋覆盖土为生物介质，开展了功能微生物筛选、功能基因簇序列分析及氯代烃生物降解等系列研究，结论如下：　　1）考察了典型垃圾填埋覆盖土的甲烷氧化能力，发现重庆地区的甲烷氧化能力较强，初始体积浓度14％的甲烷经150 h降解率达到99.8%。土样在pH值6.0至-8.8的范围内均具有较强的甲烷氧化能力，在pH=7.02甲烷降解能力最强，添加NMS培养基可提高土壤微生物的甲烷氧化效果。　　2）分离了一株可降解TCE的甲烷氧化菌JTC3，该菌株对TCE有较强的降解能力，初始浓度为15.64μmol/L时，5 d降解率为93.79％。且低浓度的TCE（12.55-20.76μmol/L）对甲烷氧化有促进作用。经16S rDNA序列测序比对及系统发育树分析鉴定为兼性甲烷氧化菌Methylocystis sp。用半巢式PCR法分段扩增菌株的颗粒性甲烷单加氧酶（pMMO）基因簇并进行T-A克隆测序，经扩增、测序、拼接得到了3227 bp的pmoCAB基因簇序列，包括771 bp的pmoC基因、759 bp的pmoA基因、1260 bp的pmoB基因和2个非编码中间序列，所对应γ、β、α亚基理论分子量分别为29.1 kDa、28.6 kDa和45.6 kDa。　　3）从填埋了2年的重庆市长生桥填埋场富集到以甲烷为碳源的混合菌群，命名为SWA1。SWA1能以甲烷为碳源，实现连续稳定的离位培养，非甲烷类水溶性碳源会促使不能利用甲烷的菌株成为优势菌种。低浓度（14.06μmol/L）TCE可以促进混合菌群的生长，辅酶因子铜离子浓度的升高促进混合菌群的生长及甲烷降解能力的提高。　　4）对混合菌群 SWA1生物降解 TCE的工艺条件进行了优化。在14.06-110.23μmol/L TCE浓度范围内，TCE浓度越高降解速率越高，降解率在TCE总初始浓度为110.23μmol/L时达到最大87.79%。TCE的生物降解依靠生物酶的催化作用，在共代谢基质甲烷消耗完之后，微生物存在的加氧酶依然可以维持 TCE降解活性，但是随着能量的不断消耗，TCE降解会减弱。铜离子能够促进混合菌群生长和TCE降解，TCE在低铜离子浓度区（0-0.75μmol/L）和高铜离子浓度区（1-15μmol/L）分别存在降解峰值，当c(Cu2+)=0.03μmol/L时，TCE降解率达到最高95.75%，当铜离子浓度为5μmol/L时，TCE降解率达到最高的84.75%。　　5）通过逆转录实时荧光定量PCR（Real-time quantitative reverse transcription PCR，RT-qPCR）、T-A克隆测序和高通量测序技术分析混合菌群的群落结构变化，推演了TCE生物降解机理。荧光定量PCR结果表明，颗粒型甲烷单加氧酶（particulate methane monooxygenase，pMMO）是TCE降解过程中的关建酶，在铜离子浓度为0.03μmol/L时，pmoA基因和mmoX基因的转录表达丰度出现峰值，添加铜离子有利于LmpH基因的表达。同时低浓度TCE（＜32.17μmol/L）的添加对pmoA的表达影响不大。T-A克隆结果表明，TCE的加入改变微生物群落结构，使甲烷氧化菌丰度减少，增加了非甲烷氧化菌的种类，同时甲烷及 TCE的代谢产物为非甲烷氧化菌提供了原料，使得原来低丰度的微生物复苏。高通量测序结果表明，混合菌群 SWA1中优势微生物为甲基孢囊菌科 Methylocystaceae的甲烷氧化菌，此外还有乳球菌属 Lactococcus和芽胞杆菌属Bacillus等可降解TCE的微生物。铜离子浓度的增加刺激II型甲烷氧化菌的生长，同时对其他非甲烷氧化菌的抑制作用使得高铜离子浓度范围混合菌群的微生物多样性降低，铜离子低浓度区间0-0.75μmol/L和高浓度区间1-15μmol/L，TCE降解机理不同，低浓度区间主要是 pMMO，溶解型甲烷单加氧酶（Soluble Methane Monooxygenases，sMMO）共代谢降解TCE及TCE直接降解。在高浓度铜离子区间内，苯酚羟化酶等非甲烷氧化菌的共代谢作用对TCE降解同样起到了关键作用。

目录

封面

声明

中文摘要

英文摘要

目录

1 绪论

1.1TCE污染现状概述

1.2TCE生物修复方法概述

1.3 TCE好氧共代谢生物降解研究进展

1.4 垃圾填埋覆盖土微生物多样性

1.5 混合菌群培养机制在污染物降解中的应用

1.6 分子生物学技术在TCE生物降解中的应用

1.7 论文的研究内容与方法

2 材料与方法

2.1 实验材料与试剂

2.2 实验方法

2.3 操作条件优化

2.4 分析方法

3 生活垃圾填埋覆盖土甲烷氧化能力分析

3.1 不同地区垃圾填埋覆盖土理化性质分析

3.2 不同地区垃圾填埋覆盖土甲烷氧化能力

3.3 pH对覆盖土甲烷氧化能力的影响

3.4 无机盐对覆盖土甲烷氧化的影响

3.5 本章小结

4 甲烷氧化菌JTC3的分离、鉴定及关键酶特性研究

4.1 甲烷氧化菌JTC3的分离纯化

4.2 甲烷氧化菌JTC3降解氯代烃

4.3 甲烷氧化菌JTC3的16S rDNA序列分析

4.4 菌株的pmoCAB基因簇分段扩增及序列分析

4.5 pmoCAB基因簇序列分析

4.6 本章小结

5 可降解TCE混合菌群的富集与生物特性

5.1 垃圾填埋覆盖层中混合菌群的富集筛选

5.2 混合菌群SWA1的碳源优化

5.3 铜离子初始浓度对混合菌群生物特性影响

5.4 混合菌群SWA1 TCE耐受性分析

5.5 本章小结

6 混合菌群SWA1共代谢降解TCE研究

6.1 混合菌群TCE共代谢降解生长基质优化

6.2 细菌初始浓度对SWA1共代谢降解TCE的影响

6.3 TCE初始浓度对混合菌群共代谢降解TCE的影响

6.4 铜离子对混合菌群共代谢降解TCE的影响

6.5 本章小结

7 混合菌群SWA1共代谢降解TCE机理分析

7.1混合菌群SWA1共代谢降解TCE机理分析

7.2 不同铜离子浓度下混合菌群SWA1降解TCE的机制分析

7.3 本章小结

8 结论与展望

8.1 结论

8.2 论文创新点

8.3 不足与展望

致谢

参考文献

个人简历、在学期间发表的学术论文及取得的研究成果