黄连木LEAFY同源基因cDNA全长的克隆与载体构建

摘要

黄连木(PistaciachinesisBunge)是一种重要的木本能源植物，在我国分布范围广，其果实和种子含油量高(种子含油率为42.46％，出油率为20％～30％)、油质好，是发展生物柴油的极具开发前景的油料树种。但由于黄连木童期过长(12年以上)，使得黄连木常规育种工作和遗传改良进展缓慢，进而严重制约了黄连木能源林的建设。LEAFY(LFY)同源基因是花分生组织特征基因，存在于所有的高等植物中，它不仅控制着营养分生组织向花分生组织的转变，而且还控制着开花时间，是开花启动过程的主控基因，在成花调控网络中处于关键位置。组成型表达LFY基因，可以使拟南芥提早开花，转基因研究表明，LFY基因的过量表达还可缩短欧洲山杨和柑橘的童期，使水稻、菊花、烟草等的花期提前、生育期缩短。近年来国内外已经从果树、花卉、粮食作物等30多种植物中克隆到LFY同源基因。目前尚未见到黄连木LFY同源基因的相关报道。研究LFY同源基因对于调节植物开花、了解黄连木童期的分子调控机制具有十分重要的意义。
　　 cDNA末端快速扩增(RapidamplificationofcDNAends，RACE)技术是一种快速克隆cDNA末端的方法，目前，该方法被广泛应用于未知碱基序列基因的克隆，尤其是SMARTTMRACE技术更为人们所青睐。该方法基于PCR技术，步骤少，耗时短，只需知道mRNA内部很短的一段序列或一小段cDNA(如EST)即可用此法克隆出未知的序列从而得到全长基因。
　　 本研究以黄连木花蕾为材料，运用RT-PCR和RACE技术分离出黄连木LFY同源基因，对该基因进行了序列分析及功能预测，并将其构建到植物表达载体和原核表达载体中，为以后对该基因的功能、分子机理等的研究奠定了基础。本文的主要研究结果如下：
　　 1.基因克隆及序列分析：从黄连木幼蕾中提取总RNA，根据NCBI数据库已发表的植物LFY同源基因3’端保守区序列设计简并引物，利用RT-PCR技术获得361bp的LFY同源cDNA片段，然后以此序列设计特异性引物，利用RACE技术获得了1374bp的黄连木LFY同源基因全长cDNA序列(命名为PcBLFY)，包含一个1152bp的完整开放阅读框，编码383个氨基酸，该序列与其它植物已克隆的LFY基因序列高度同源。其核苷酸序列与同属于漆树科的杧果LFY基因的同源性高达94％，与龙眼、蓖麻、胡桃的同源性分别为84％、82％和78％；其编码氨基酸序列的同源性与卡亡果、麻风树、龙眼、蓖麻分别为95％、85％、84％和84％。推测PcBLFY基因可能为LFY同源基因。
　　 2.通过对黄连木雄株、雌株的花蕾中分离到的PcBLFY基因序列进行比对发现，两种不同性别来源的PcBLFY基因在第52位、394位和1105位表现出单核苷酸的多态性，其中雄株在这三个位点的碱基分别为G，A，A和C，T，G，分别编码Val，Ile，Thr和Leu，Leu，Ala；雌株在该位点的碱基则为C，T，A，编码Leu，Leu，Thr，雌雄间单核苷酸的改变导致在该位点的氨基酸的改变。
　　 3.植物表达载体的构建：选择酶切位点BglⅡ和BstEⅡ，将PcBLFY基因的编码序列插入到植物表达载体pCAMBIA1305.1中，通过PCR鉴定及测序检测，得到重组质粒，并将其转化到农杆菌工程菌AGL1中。
　　 4.原核表达载体的构建：将PcBLFY基因的编码序列通过酶切位点NdeⅠ和HindⅢ插入到原核表达载体pET-28a中，成功构建了该基因的原核表达载体，并通过E.coliBL21(DE3)实现了PcBLFY基因在大肠杆菌表达系统中高效重组表达，同时利用Ni2+柱亲和层析法对重组蛋白进行了分离纯化，得到较高纯度的目标蛋白。
　　 本研究成功地从童期较长的黄连木植物中分离克隆到LFY全长同源基因，并对不同性别来源PcBLFY基因进行了序列分析，本项目为进一步研究黄连木开花的分子调控机制，并通过导入LFY基因来培育短童期的黄连木奠定了基础；同时该基因在雌雄间单核苷酸的差异性也将为童期黄连木植株的雌雄鉴定奠定了分子基础。