血管内皮细胞向间质细胞转化在创伤愈合过程中的作用研究

摘要

第一部分人病理性瘢痕组织及小鼠创伤愈合过程中存在EnMT　　 目的:观察人病理性瘢痕组织中是否存在EnMT;观察小鼠创伤愈合过程中是否存在EnMT,及其在创伤愈合过程中的表达情况。　　 方法:临床收集人病理性瘢痕组织及正常皮肤各10个标本,将标本制成石蜡切片,通过免疫荧光方法检测FⅧ和α-SMA表达变化。选取雄性4～6周龄昆明系小鼠48只,建立背部正中近颈侧皮肤1.5×1.5cm2的全层切创伤模型,分别于伤后3、5、7、9、12和14d随机处死8只小鼠并切取创面及创沿组织,8只未造模小鼠切取正常皮肤作为对照组,每组标本取4个制成冰冻切片,4个标本采用消化法分离培养血管内皮细胞,应用免疫荧光方法检测冰冻切片及分离培养的内皮细胞FⅧ和α-SMA表达变化。　　 结果:免疫荧光检测结果显示病理性瘢痕组织及创伤愈合过程中均存在FⅧ、α-SMA双阳性细胞。创伤愈合过程中,正常对照组皮肤存在少量FⅧ、α-SMA双阳性细胞。创伤组创后第3、5、7、9d和对照组比较有显著统计学差异(P＜0.01),双阳性细胞在FⅧ阳性细胞中比例呈单峰趋势,即在第7d时双阳性细胞比例达到峰值,创后第12d后基本恢复正常水平(p＞0.05)。　　 结论:病理性瘢痕组织及创伤愈合过程中均存在EnMT,且在创伤愈合过程中EnMT的表达呈单峰趋势。　　 第二部分 TGF-β1对HUVECs的促EnMT作用研究　　 目的:观察不同浓度TGF-β1对内皮细胞的促EnMT作用影响,探讨EnMT在病理性瘢痕形成和创伤愈合过程中的作用机制。　　 方法:分离培养人脐静脉内皮细胞,采用不同浓度的TGF-β1(10、25、和50 ng/ml)刺激细胞72h后,倒置显微镜观察诱导后细胞形态变化,免疫荧光方法检测FⅧ和α-SMA表达变化,RT-PCR检测VE-钙粘蛋白(VE-Cadherin),α-SMA和Ⅰ型胶原基因表达变化。　　 结果:正常对照组内皮细胞呈铺路石样生长,TGF-β1刺激组内皮细胞由铺路石样形态向梭形转化。免疫荧光检测可见对照组含有少量FⅧ,α-SMA的双阳性细胞。TGF-β1组α-SMA,FⅧ双阳性细胞明显增多,并且具有明显的浓度依赖性(P＜0.05,P＜0.01)。RT-PCR检测结果显示,TGF-β1刺激导致内皮细胞特异性标记物VE-钙粘蛋白(VE-cadherin)基因的表达显著减少(P＜0.05),随着TGF-β1刺激浓度的增加,VE-钙粘蛋白基因表达呈明显的下降趋势;相反,内皮细胞间质性标记物α-SMA和Ⅰ型胶原基因的表达显著增加(P＜0.05,P＜0.01),并且具有明显的浓度依赖性。　　 结论:TGF-β1刺激内皮细胞后,细胞表型和功能均表现为间质细胞特性,提示TGF-β1具有促进内皮细胞向间质细胞转化(EnMT)的作用,并且其促EnMT效应具有明显的浓度依赖性。